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Article

1 - DIFFÉRENTS NIVEAUX DE STRUCTURE DES ENZYMES

2 - DIFFÉRENTES TECHNIQUES POUR ÉTABLIR LES STRUCTURES

3 - STRUCTURE ET FONCTION DE TROIS ENZYMES

  • 3.1 - Enzymes monomériques ou multimériques : anhydrases carboniques
  • 3.2 - Enzyme allostérique : la glycogène phosphorylase
  • 3.3 - Enzyme active uniquement sous forme oligomérique : la protéase du VIH

4 - CONCLUSION

5 - GLOSSAIRE

6 - SIGLES ET NOTATIONS

Article de référence | Réf : PHA1502 v1

Différentes techniques pour établir les structures
Enzymologie structurale

Auteur(s) : Serge KIRKIACHARIAN, Julien DUMOND

Relu et validé le 02 févr. 2024

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RÉSUMÉ

Comprendre le fonctionnement des enzymes nécessite la connaissance de la structure stéréoélectronique de ces macromolécules biologiques formées de l’assemblage d’acides aminés. Les différentes techniques biochimiques et physico-chimiques mises en œuvre pour déterminer leur structure sont abordées. L’article comporte l’étude de trois enzymes aux caractéristiques structurales différentes : l’anhydrase carbonique, la glycogène phosphorylase et la protéase du virus de l’immunodéficience humaine (VIH).

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Auteur(s)

  • Serge KIRKIACHARIAN : Docteur ès-Sciences Physiques – Pharmacien - Professeur émérite de chimie thérapeutique de la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’Université Paris Sud - Praticien hospitalier chef de service honoraire des hôpitaux de Paris, France

  • Julien DUMOND : Docteur en virologie enzymologie - Consultant en entreprises pharmaceutiques, Metz, France

INTRODUCTION

Les enzymes sont des protéines, le terme protéine vient du préfixe « proto- », qui signifie en premier, en relation avec l’importance de ces macromolécules biologiques dans toute matière vivante, et le fait qu’avant 1950 la plupart des scientifiques accordaient plus de crédit au paradigme des protéines à l’origine de la vie qu’à celui des acides nucléiques à la base du vivant.

Comme toutes les protéines, une enzyme est codée par au moins un gène. Sa structure est constituée par un enchaînement d’acides aminés qui prend une conformation précise dans l’espace, afin de permettre la réalisation d’une réaction chimique spécifique. L’enzyme est donc un polymère fonctionnel de plus de 50 à 100 acides aminés suivant la définition donnée à une protéine. Grâce à des ribosomes, elle est synthétisée au cours d’un processus de traduction initié dans le cytoplasme d’une cellule ou au niveau de la matrice mitochondriale à partir d’un ARNm (acide ribonucléique messager) contenant l’information génétique.

Les recherches fondamentales et appliquées aux enzymes sont très conséquentes dans des domaines variés. De nombreuses entreprises et laboratoires investissent beaucoup de moyens humains et financiers afin de caractériser ces catalyseurs et de les exploiter au mieux pour l’espèce humaine. Avant d’utiliser ou de cibler une enzyme, les protocoles de purification doivent être clairement établis, et la connaissance de sa structure et de ses propriétés physicochimiques totalement maîtrisées.

Les enzymes ont été étudiées tout d’abord pour leur implication dans le métabolisme du vivant. Il s’agissait dans ce premier temps de molécules facilement accessibles (issues de liquides ou d’organismes simples). Quand les processus de purification ont été améliorés, de nombreuses enzymes furent isolées, puis caractérisées. Leurs possibles applications par et pour l’être humain pouvaient alors être envisagées. À l’heure actuelle, on relève trois domaines majeurs d’applications industrielles ou de ciblage des enzymes, ils nécessitent la maîtrise de nombreux domaines connexes :

  • entreprises pharmaceutiques et cosmétiques pour lesquelles la conception de médicaments et produits de bien-être impose des connaissances en chimie organique, en modélisation moléculaire, en pharmacologie, en ADMEtox (administration, distribution, métabolisme, excrétion et toxicologie), en galénique… Notons que des entreprises de service pharmaceutique se sont développées ces trente dernières années pour proposer le panel le plus complet possible de tests enzymatiques (cinétiques) ou sur récepteurs (affinité et tests fonctionnels), afin d’accompagner les laboratoires pharmaceutiques dans leurs programmes de recherche ;

  • entreprises agro-alimentaires où la fabrication de produits destinés à la consommation implique la maîtrise de la microbiologie, de la biologie végétale, du métabolisme et du fonctionnement de bio-réacteurs… ;

  • entreprises liées à l’environnement dans l’optique de générer des produits écologiques dans les domaines des biocarburants, du papier et des détergents biologiques nécessitant des connaissances en biologie végétale, en microbiologie, en écologie et en métabolisme.

Cet article est consacré à la description des techniques mises en œuvre pour la détermination de la structure des enzymes.

Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des notations et des sigles utilisés.

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-pha1502


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2. Différentes techniques pour établir les structures

Pour déterminer les différents niveaux de structures d’une enzyme après sa purification, plusieurs techniques biochimiques, chimiques et biophysiques sont disponibles. Si celles-ci sont bien établies, les outils robotiques et informatiques permettent des gains de temps considérables et une précision accrue. Les techniques les plus courantes pour établir ces structures sont indiquées ci-dessous.

2.1 Séquences primaires : protéolyses totales, limitées, séquençage d’Edman et la RT-PCR

Afin d’établir la séquence primaire d’une enzyme purifiée, il faut traiter l’échantillon afin que toutes les liaisons covalentes (essentiellement ponts disulfures) impliquées dans la structure tertiaire soient rompues.

Une fois la protéine enzymatique « linéarisée », la composition globale en acides aminés peut être déterminée. Généralement la solution protéique est placée un à deux jours sous vide dans une solution d’acide fort (acide chlorhydrique HCl 6N). La durée doit être bien estimée. En effet, une hydrolyse trop courte pourrait être incomplète (notamment pour les résidus leucine, valine et isoleucine) et une trop longue altérerait ou poserait des problèmes pour qualifier certains acides aminés (tryptophane, thréonine, sérine, tyrosine, asparagine et glutamine). Le mélange obtenu doit être analysé qualitativement et quantitativement après séparation préalable des composants (chromatographie HPLC ou UPLC couplée à la spectrométrie de masse, ou spectrophotométrie dans l’UV). À ce stade, on dispose de la nature et du nombre d’acides aminés constituant la protéine. Une hydrolyse basique peut être appliquée, cependant elle engendre plus de dégradations que l’hydrolyse acide pour l’analyse des résultats.

  • Pour déterminer la séquence primaire, un protocole, maintenant automatisé et connu depuis longtemps, est le séquençage d’Edman (figure 21). Cette technique est fondée sur l’utilisation du phénylisothiocyanate (PITC), dont la réaction en milieu basique avec l’acide aminé N-terminal de l’enzyme permet sa libération, tout en laissant intact le reste de la chaîne protéique. Le phényl-thiocarbamyl-amino-acide se cyclise et pourra être identifié par chromatographie HPLC,...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - ELIEL (E.L.), WILEN (S.H.) -   Stéréochimie des composés organiques.  -  Tec et Doc Lavoisier, Paris (1996).

  • (2) - Le BRIAND (N.), CASALEGNO (J.S.), ESCURET (V.), GAYMARD (A.), LINA (B.), OTTMANN (M.), FROBERT (E.) -   La balance HA-NA des virus influenza A(H1N1).  -  Virologie (2016).

  • (3) - AL ALI (A.) -   Le dosage des cytochromes P450 (CYPs) humains par spectrométrie de masse : applications en toxicologie.  -  Thèse soutenue en 2014 sous la direction de BEAUNE (P.), discipline : Médicaments et toxicologie, Université Paris V René Descartes, INSERM UMRS 1147 (2014).

  • (4) -   Document DARBON (H.)  -  http://biologie.univ-mrs.fr/masterBBSG/images/pdf/structures%20secondaires.pdf (autorisation d’utilisation)

  • (5) -   Document LEBLANC (B.)  -  http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrooke.ca/2b.html (autorisation d’utilisation)

  • ...

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