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Auteur(s)
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Hélène ROUX de BALMANN : Chargée de recherches
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Victor SANCHEZ : Directeur de recherches - CNRS‐UMR 55‐03 - Laboratoire de génie chimique - Université Paul‐Sabatier, Toulouse
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Le principe de l’électrophorèse, qui est la migration de substances chargées sous l’influence d’un champ électrique continu, a été décrit il y a un siècle par Kohlrausch. Il a fallu attendre jusqu’en 1937 pour que Tiselius montre l’utilité de la méthode à frontière mobile pour séparer les protéines du sérum sanguin. À l’heure actuelle, l’électrophorèse est devenue la méthode analytique la plus employée dans le domaine de la biologie en raison de ses performances et de sa relative simplicité de mise en œuvre. Elle a contribué, ainsi d’ailleurs que la chromatographie, à de grands progrès réalisés en biochimie et en biotechnologie, grâce à la détection et à l’analyse des différents constituants d’un milieu biologique complexe. Là où Tiselius séparait 5 constituants, plus de 1 000 peuvent maintenant être identifiés par électrophorèse bidimensionnelle sur gel.
Ces progrès considérables ont été accomplis grâce à une avancée scientifique tant expérimentale que théorique, mais aussi grâce à une instrumentation de plus en plus sophistiquée.
Les théories sur la mobilité électrophorétique, la migration et la dissociation des électrolytes ont été étendues à tous les types d’électrophorèse (électrophorèse de zone, focalisation isoélectrique, isotachophorèse...). Elles ont permis de simuler le déplacement des produits. Les effets dispersifs, inhérents à tout procédé de séparation, ont été mieux perçus et pris en compte dans les équations de transport. Un effet important, l’électrohydrodynamique, a même été récemment découvert.
Au plan expérimental, des matériaux de plus en plus performants, utilisés pour constituer des gels ou pour revêtir les parois des chambres d’électrophorèse, ont permis de limiter l’adsorption et l’électro‐osmose, et d’améliorer leur durée de vie. De nouvelles méthodes ont été proposées pour caractériser les produits, les désorber et les recueillir. De nouveaux procédés ont été conçus et développés, comme l’électrophorèse capillaire qui connaît actuellement un essor important.
Très performante dans le domaine de l’analyse, l’électrophorèse a donc tout naturellement suscité un intérêt en tant que méthode préparative. Comment passer de l’analyse de quelques nanogrammes ou microgrammes à la production de quelques milligrammes, voire de grammes, tout en conservant la même finesse de séparation ? Pour apporter des réponses à cette question, des chercheurs ont essayé d’extrapoler et d’améliorer les procédés existant dans le domaine analytique ou de développer de nouvelles techniques plus spécialement adaptées aux domaines préparatifs.
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Procédés préparatifs directement dérivés des techniques analytiques
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2. De l’analytique au préparatif : problème de changement d’échelle
La définition de l’électrophorèse préparative et la frontière de celle‐ci avec le domaine analytique sont très délicates à établir. Des expériences qui étaient il y a quelques décennies considérées comme relevant de l’analyse peuvent maintenant parfois être qualifiées de « préparatives », dès lors que les produits séparés sont récupérés pour être utilisés lors d’opérations ultérieures. En effet, d’énormes progrès ont rendu la détection de plus en plus sensible, la récupération de plus en plus efficace, ce qui permet des dosages quantitatifs. Ainsi, de très faibles quantités (de l’ordre du microgramme) sont suffisantes pour déterminer la séquence d’une protéine. La cristallisation des protéines ou des substances, ne requiert également que quelques milligrammes. Enfin, des essais plus spécifiquement liés à l’activité biologique peuvent être réalisés avec des quantités de produit inférieures au gramme. Pour toutes ces applications, l’électrophorèse est un excellent outil de purification. Cependant, le passage de l’analyse à la préparation, quelle que soit l’échelle de quantité concernée, pose des problèmes à divers niveaux. Il faut en effet pouvoir d’une part augmenter les quantités de produits séparés et d’autre part les récupérer, ce qui peut être fait, selon les cas, en une ou plusieurs opérations.
Pour augmenter les quantités traitées, on peut soit accroître les dimensions du système soit travailler avec des échantillons plus concentrés. Dans le premier cas, le principal problème réside dans le contrôle de l’effet Joule. En effet, l’équation [9] montre que le gradient thermique au sein d’un gel, par exemple, varie sensiblement avec son épaisseur dont l’augmentation peut donc provoquer des distorsions des bandes en faisant varier la mobilité. La récupération des produits devient alors très délicate et la probabilité de contamination est accrue, bien que l’électro‐élution soit de plus en plus performante. Dans le cas de l’IEF (cf. § ...
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