Bibliographie & annexes
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Auteur(s)
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Hélène ROUX de BALMANN : Chargée de recherches
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Victor SANCHEZ : Directeur de recherches - CNRS‐UMR 55‐03 - Laboratoire de génie chimique - Université Paul‐Sabatier, Toulouse
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Le principe de l’électrophorèse, qui est la migration de substances chargées sous l’influence d’un champ électrique continu, a été décrit il y a un siècle par Kohlrausch. Il a fallu attendre jusqu’en 1937 pour que Tiselius montre l’utilité de la méthode à frontière mobile pour séparer les protéines du sérum sanguin. À l’heure actuelle, l’électrophorèse est devenue la méthode analytique la plus employée dans le domaine de la biologie en raison de ses performances et de sa relative simplicité de mise en œuvre. Elle a contribué, ainsi d’ailleurs que la chromatographie, à de grands progrès réalisés en biochimie et en biotechnologie, grâce à la détection et à l’analyse des différents constituants d’un milieu biologique complexe. Là où Tiselius séparait 5 constituants, plus de 1 000 peuvent maintenant être identifiés par électrophorèse bidimensionnelle sur gel.
Ces progrès considérables ont été accomplis grâce à une avancée scientifique tant expérimentale que théorique, mais aussi grâce à une instrumentation de plus en plus sophistiquée.
Les théories sur la mobilité électrophorétique, la migration et la dissociation des électrolytes ont été étendues à tous les types d’électrophorèse (électrophorèse de zone, focalisation isoélectrique, isotachophorèse…). Elles ont permis de simuler le déplacement des produits. Les effets dispersifs, inhérents à tout procédé de séparation, ont été mieux perçus et pris en compte dans les équations de transport. Un effet important, l’électrohydrodynamique, a même été récemment découvert.
Au plan expérimental, des matériaux de plus en plus performants, utilisés pour constituer des gels ou pour revêtir les parois des chambres d’électrophorèse, ont permis de limiter l’adsorption et l’électro‐osmose, et d’améliorer leur durée de vie. De nouvelles méthodes ont été proposées pour caractériser les produits, les désorber et les recueillir. De nouveaux procédés ont été conçus et développés, comme l’électrophorèse capillaire qui connaît actuellement un essor important.
Très performante dans le domaine de l’analyse, l’électrophorèse a donc tout naturellement suscité un intérêt en tant que méthode préparative. Comment passer de l’analyse de quelques nanogrammes ou microgrammes à la production de quelques milligrammes, voire de grammes, tout en conservant la même finesse de séparation ? Pour apporter des réponses à cette question, des chercheurs ont essayé d’extrapoler et d’améliorer les procédés existant dans le domaine analytique ou de développer de nouvelles techniques plus spécialement adaptées aux domaines préparatifs.
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Procédés conçus pour leur aspect préparatif
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3. Procédés préparatifs directement dérivés des techniques analytiques
3.1 Électrophorèse sur gel avec récupération des produits
L’excellente résolution et la relative simplicité de mise en œuvre de l’électrophorèse sur gel à des fins d’analyse a naturellement conduit à essayer de l’utiliser en tant que méthode préparative. Le principe en est simple (figure 2). Il consiste à réaliser un processus comprenant une séparation (électrophorèse) et une récupération des produits séparés (élution).
HAUT DE PAGE
Plusieurs modes de séparation peuvent être mis en œuvre. Les deux principaux sont l’électrophorèse de zone [12] , dans laquelle les constituants sont séparés suivant leur mobilité électrophorétique, et la focalisation isoélectrique IEF [13] dans laquelle les produits sont séparés suivant leur point isoélectrique pI. La première idée a été naturellement d’employer pour cette étape les gels et les solutions tampons qui fournissent les meilleurs résultats à l’échelle analytique : gels de polyacrylamide PAA et d’agarose, avec une préférence pour le PAA qui offre, dans bien des cas, une meilleure résolution puisqu’il limite l’électro‐osmose. Il permet, par ailleurs, de préparer des gels de différentes porosités donnant un effet tamis. En électrophorèse de zone, la séparation est alors le résultat d’un couplage entre la migration électrophorétique et l’effet tamis (fonction de la taille des molécules) : cette technique est connue sous le nom de PAGE (de l’anglais Poly Acrylamide Gel Electrophoresis ). On peut également fabriquer des gels présentant un gradient de porosité (gradient PAGE). Enfin, cette électrophorèse peut être réalisée en conditions dénaturantes, l’agent dénaturant le plus couramment employé étant le SDS (dodécylsulfate de sodium) :...
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BIBLIOGRAPHIE
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(1) - TISELIUS (A.) - A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. - Trans. Faraday Soc., 33, p. 524‐531 (1937).
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(2) - VESTERBERG (O.) - A short history of electrophoretic methods. - Electrophoresis, 14, p. 1243‐1249 (1993).
-
(3) - OVERBEEK (J.Th.G.), WIERSERMA (P.H.) - The interpretation of electrophoretic mobilities - – dans : BIER (M.). – Electrophoresis : theory, methods and applications. Vol. II, chap. 1, p. 1‐49, Academic Press New York London (1967).
-
(4) - OVERBEEK (J.Th.G.), LIJKLEMA (J.) - Electrical potentials in colloidal systems - – dans : BIER (M.). – Electrophoresis : theory, methods and applications. Vol. I, chap. 1, p. 1‐30, Academic Press New York London (1959).
-
(5) - HENRY (D.C.) - The cataphoresis of suspensed particles. I. The equation of cataphoresis. - Proc. Roy. Soc., p. 106‐129 (1931).
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Divers appareils dont le principe et le fonctionnement ont été décrits dans les paragraphes précédents sont disponibles sur le marché. Le tableau 1 fournit une liste non exhaustive des fournisseurs et des matériels qu’ils proposent. Pour chaque appareil, le constructeur dispose en général d’un grand nombre de fiches d’application qui peuvent être utiles pour orienter un choix en fonction d’un objectif de purification.
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