Dispositif expérimental
Imagerie microscopique 3D de phase - Méthode d’imagerie sans marquage

En microscopie classique, lors de l’utilisation d’un système d’illumination-détection incohérent, l’image enregistrée résulte d’une interaction complexe entre l’illumination incohérente et le spécimen (objet). Le contraste observé permet d’étudier efficacement la morphologie, mais ne donne pas directement d’information quantitative sur les caractéristiques d’un spécimen.

Pour surmonter ces problèmes, notamment en biologie, les techniques employées nécessitent souvent un marquage fonctionnel des échantillons comme pour les microscopies de fluorescence, confocale, STED (Stimulated-Emission-Depletion), PALM (Photo-Activated Localization Microscopy), SIM (Structured Illumination Microscopy), ou leurs variantes. L’imagerie basée sur les marqueurs fluorescents est aujourd’hui la technique de choix employée en imagerie microscopique, grâce à la grande variété de fluorophores développés et aux résolutions atteintes. Le STED et le PALM ont notamment été récompensés par le prix Nobel en 2014. Cependant, ces modes d’imagerie peuvent parfois poser des problèmes (phototoxicité, photoblanchiment, densité d’énergie importante) et pour les scientifiques ne pouvant utiliser ces systèmes, d’autres types de microscopie, sans marquage, doivent être utilisés. Il existe différents types d’imagerie sans marquage : CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), effet Raman, génération de second harmonique ou encore mesure de phase. Les techniques de génération d’harmoniques ou basées sur l’effet Raman permettent d’observer un contraste basé sur les propriétés optiques du spécimen, mais nécessitent une instrumentation coûteuse associée à une mise en œuvre délicate (laser femtoseconde).

L’holographie et la tomographie diffractive s’appuient sur une mesure du changement de phase induit sur l’onde d’illumination par l’échantillon, mais à l’inverse du DIC (Differential Interference Contrast) ou du contraste de phase, elles permettent d’accéder à une mesure quantitative de l’indice de réfraction et/ou de la phase. Cet article présente les concepts nécessaires à la compréhension de ce type de mesure et leur réalisation avec des montages interférométriques et tomographiques. En se basant sur les principes de l’holographie numérique et après une étape de traitements numériques, il est possible d’obtenir une série de données par tomographie, nécessaires à la résolution d’un problème inverse lié au mécanisme de formation de l’image dans un microscope. La solution de ce problème inverse permet la reconstruction d’une image de l’absorption et de l’indice optique local d’un spécimen 3D.

Afin de comprendre le mécanisme de formation d’image, les notions de propagation d’une onde lumineuse en utilisant l’espace de Fourier (spectre spatial) et le principe du spectre angulaire associé sont présentés en première partie, pour aboutir à la formulation des modèles directs (projectif et diffractif).

La microscopie holographique est présentée, et la limite de résolution est étudiée grâce au contenu fréquentiel (bande passante). La tomographie est décrite avec un montage expérimental et des mesures sur des spécimens.

Enfin, des moyens pour améliorer la résolution de telles images sont également présentés au niveau expérimental et algorithmique.