Bibliographie & annexes
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RÉSUMÉ
L'imagerie 3D de phase est une alternative sans marquage à la microscopie de fluorescence. L'holographie numérique permet d'accéder à une information quantitative en phase, mais souffre d'une résolution limitée en 3D. Cet article présente la tomographie diffractive qui se base sur l'holographie en améliorant la résolution tridimensionnelle des images et fournit l'indice de réfraction et l'absorption dans le volume d’un spécimen. Cette technique est un complément intéressant à l'imagerie de fluorescence comme mode d'imagerie alternatif ou complémentaire. Les principes de l’holographie, de la tomographie et des exemples expérimentaux sont présentés et discutés.
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3D phase imaging is a non-stain alternative to fluorescence microscopy. Digital holography provides access to quantitative phase information, but suffers from a limited 3D resolution. This article presents diffractive tomography based on holography with improved three-dimensional resolution of images, and which provides the refractive index and absorption in the bulk of a specimen. This technique is useful for fluorescence imaging as an alternative or a complementary imaging method. The principles of holography, and tomography are discussed, and experimental examples are presented.
Auteur(s)
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Matthieu DEBAILLEUL : Ingénieur de recherche à l’Institut de recherche en informatique, mathématiques, automatique et signal (IRIMAS), Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France
-
Bruno COLICCHIO : Maître de conférences à l’Institut de recherche en informatique, mathématiques, automatique et signal (IRIMAS), Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France,
INTRODUCTION
En microscopie classique, lors de l’utilisation d’un système d’illumination-détection incohérent, l’image enregistrée résulte d’une interaction complexe entre l’illumination incohérente et le spécimen (objet). Le contraste observé permet d’étudier efficacement la morphologie, mais ne donne pas directement d’information quantitative sur les caractéristiques d’un spécimen.
Pour surmonter ces problèmes, notamment en biologie, les techniques employées nécessitent souvent un marquage fonctionnel des échantillons comme pour les microscopies de fluorescence, confocale, STED (Stimulated-Emission-Depletion), PALM (Photo-Activated Localization Microscopy), SIM (Structured Illumination Microscopy), ou leurs variantes. L’imagerie basée sur les marqueurs fluorescents est aujourd’hui la technique de choix employée en imagerie microscopique, grâce à la grande variété de fluorophores développés et aux résolutions atteintes. Le STED et le PALM ont notamment été récompensés par le prix Nobel en 2014. Cependant, ces modes d’imagerie peuvent parfois poser des problèmes (phototoxicité, photoblanchiment, densité d’énergie importante) et pour les scientifiques ne pouvant utiliser ces systèmes, d’autres types de microscopie, sans marquage, doivent être utilisés. Il existe différents types d’imagerie sans marquage : CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), effet Raman, génération de second harmonique ou encore mesure de phase. Les techniques de génération d’harmoniques ou basées sur l’effet Raman permettent d’observer un contraste basé sur les propriétés optiques du spécimen, mais nécessitent une instrumentation coûteuse associée à une mise en œuvre délicate (laser femtoseconde).
L’holographie et la tomographie diffractive s’appuient sur une mesure du changement de phase induit sur l’onde d’illumination par l’échantillon, mais à l’inverse du DIC (Differential Interference Contrast) ou du contraste de phase, elles permettent d’accéder à une mesure quantitative de l’indice de réfraction et/ou de la phase. Cet article présente les concepts nécessaires à la compréhension de ce type de mesure et leur réalisation avec des montages interférométriques et tomographiques. En se basant sur les principes de l’holographie numérique et après une étape de traitements numériques, il est possible d’obtenir une série de données par tomographie, nécessaires à la résolution d’un problème inverse lié au mécanisme de formation de l’image dans un microscope. La solution de ce problème inverse permet la reconstruction d’une image de l’absorption et de l’indice optique local d’un spécimen 3D.
Afin de comprendre le mécanisme de formation d’image, les notions de propagation d’une onde lumineuse en utilisant l’espace de Fourier (spectre spatial) et le principe du spectre angulaire associé sont présentés en première partie, pour aboutir à la formulation des modèles directs (projectif et diffractif).
La microscopie holographique est présentée, et la limite de résolution est étudiée grâce au contenu fréquentiel (bande passante). La tomographie est décrite avec un montage expérimental et des mesures sur des spécimens.
Enfin, des moyens pour améliorer la résolution de telles images sont également présentés au niveau expérimental et algorithmique.
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KEYWORDS
holography | microscopy | optical index
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Dispositif expérimental3. Microscopie par tomographie 3D : modèle par projection ou diffractif
Pour augmenter la résolution des images, il est possible de modifier les conditions d’éclairement afin d’obtenir plusieurs vues du même spécimen, ou encore de faire tourner celui-ci.
Dans tous les cas, la reconstruction d’un objet en tomographie repose sur plusieurs mesures extérieures à cet objet en variant les conditions d’illumination. L’ensemble du processus repose sur plusieurs étapes :
-
1. établir le problème direct, c’est-à-dire le modèle donnant le lien entre la fonction objet recherchée et la mesure ;
-
2. résoudre le problème inverse ;
-
3. du point de vue expérimental, enregistrer les projections en se basant sur un montage interférométrique ou holographique ;
-
4. améliorer la résolution par un procédé de synthèse d’ouverture.
Dans une première approche, on peut négliger les phénomènes de diffraction : on considère que les trajets des rayons sont rectilignes. La reconstruction de l’indice de réfraction repose alors sur la rétroprojection filtrée ou le théorème de la coupe centrale, utilisés également en tomodensitométrie à rayon X. Le problème de la diffraction est ensuite traité.
3.1 Projection
Expérimentalement, l’objet est illuminé par une onde plane d’intensité I 0, et on mesure l’intensité I (ξ) du champ optique obtenu après passage dans l’objet sur un capteur plan 2D (haut de la figure 7). Ce champ est atténué par l’absorption et la diffusion dues à l’objet, lui-même représenté par une fonction objet f (x, y). Cette atténuation est exprimée par la loi de Beer-Lambert : en traversant une épaisseur élémentaire dη, l’intensité varie d’une quantité :
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Microscopie par tomographie 3D : modèle par projection ou diffractif
BIBLIOGRAPHIE
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(1) - ERSOY (O.K.) - Diffraction, Fourier optics and imaging. - John Wiley and Sons (2006).
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(2) - VERRIER (N.), ATLAN (M.) - Off-axis digital hologram reconstruction : some practical considerations. - Appl Opt., AO, DOI : 10.1364/AO.50.00H136, 50(34), p. H136-H146 (2011).
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(3) - LIU (H.), BAILLEUL (J.), SIMON (B.), DEBAILLEUL (M.), COLICCHIO (B.), HAEBERLÉ (O.) - Tomographic diffractive microscopy and multiview profilometry with flexible aberration correction. - Applied optics, 53(4), p. 748-755 (2014).
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(4) - DUBOIS (F.), REQUENA (M.-L.N.), MINETTI (C.), MONNOM (O.), ISTASSE (E.) - Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. - Appl. Opt., AO, DOI : 10.1364/AO.43.001131, 43(5), p. 1131-1139 (2004).
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(5) - KIM (M.K.) - Principles and techniques of digital holographic microscopy. - SR, SPIVJ2, DOI : 10.1117/6.0000006, 1(1), p. 018005 (2010).
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DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Method and apparatus for simultaneous amplitude and quantitative phase contrast imaging by numerical reconstruction of digital holograms WO2000020929A1
Digital holographic microscope with fluid systems WO2014044823A1
Digital holographic microscope with electro-fluidic system, said electro-fluidic system and methods of use EP3196631A1
Apparatus and method for digital holographic imaging WO2003048868A1
Method for and use of digital holographic microscopy and imaging on labelled cell samples US8937756B2
Holographic microscopy and method to investigate nano-sized objects WO2010037861A1
Digital holographic device WO2015118475A1
Optical system for a holographic microscope US20130003073A1
Common-mode digital holographic microscope US20160131882A1
Digital holography three-dimensional imaging apparatus and digital holography three-dimensional imaging method US9599960B2
Procédé de détermination de l’état d’une cellule EP3274694A1
Microscope générant une représentation tridimentionnelle d’un objet et images générées par ce miscroscope FR2782173A1
HAUT DE PAGE
Lyncée Tec – Digital Holographic Microscopes https://www.lynceetec.com/
Phasics, the phase control company http://phasicscorp.com/
Qmod Holographic And Fluorescence Microscopy. In One Single System http://www.ovizio.com/
iPrasense – Live Cell Imaging http://www.iprasense.com/
Nanolive – label-free 3D live cell imaging technology https://nanolive.ch/...
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