Présentation
RÉSUMÉ
La chromatographie en phase liquide HPLC est une technique analytique employée dans de nombreux secteurs d'activité. Des solutions innovantes en termes de phases stationnaires et d'instruments sont apparues afin d'en augmenter la productivité. En parallèle, des stratégies orthogonales permettant de modifier la sélectivité et la rétention se sont développées. Enfin, cette technique s'est aussi adaptée à la caractérisation de protéines thérapeutiques, en plein essor dans le domaine pharmaceutique.
Lire cet article issu d'une ressource documentaire complète, actualisée et validée par des comités scientifiques.
Lire l’articleABSTRACT
High performance liquid chromatography (HPLC) is an analytical technique suitable for a large variety of applications. Some innovative solutions, in terms of stationary phases and instrumentation, were introduced to improve productivity. In parallel, some alternative strategies allowing severe modifications of selectivity and retention were also developed. Finally, this approach was also adapted for the characterisation of therapeutic proteins, which is currently a hot topic in the pharmaceutical industry
Auteur(s)
-
Davy GUILLARME : Chargé d'enseignement Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, École des Sciences pharmaceutiques, Université de Genève
INTRODUCTION
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique clé, utilisée dans de nombreux secteurs d'activité, pour l'analyse de matrices agroalimentaires, environnementales et pharmaceutiques. Cette technique séparative peut être utilisée aussi bien pour des analyses purement qualitatives, que pour des applications quantitatives. Durant ces dernières années, les technologies employées en HPLC (phases stationnaires, phases mobiles, instrumentation...) ont évolué de manière très rapide, afin de répondre à certaines exigences des utilisateurs. Trois axes principaux d'amélioration ont été suivis.
Le premier axe de développement de l'HPLC est l'augmentation du débit d'analyse, afin d'obtenir des séparations cinq à dix fois plus rapides qu'auparavant, ainsi que la possibilité d'atteindre des séparations à plus haut pouvoir de séparation (à haute résolution). Pour cela, il est possible d'utiliser des supports chromatographiques innovants tels que les colonnes monolithiques, les colonnes remplies de particules poreuses de moins de 2 μm ou les colonnes remplies de particules superficiellement poreuses de moins de 3 μm. Il est également important de garder en tête qu'une augmentation de la température de la phase mobile permet une amélioration significative des performances chromatographiques. Cependant, afin de tirer tous les bénéfices de la chromatographie rapide et/ou à haute résolution, une instrumentation adaptée est nécessaire et des développements importants ont été réalisés dans ce sens au cours des dix dernières années.
Un autre axe de développement concerne l'utilisation de modes alternatifs de chromatographie. En effet, la chromatographie liquide à polarité des phases inversées (RPLC) est de loin la plus utilisée aujourd'hui mais il peut être intéressant d'avoir recours à des modes de séparations alternatifs pour moduler les sélectivités et rétentions de certains composés problématiques. Deux modes peuvent avoir de l'intérêt, il s'agit de la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et de la chromatographie supercritique (SFC). La première de ces deux approches est particulièrement adaptée à l'analyse de composés très hydrophiles (sucres, acides aminés) et/ou ionisables (molécules pharmaceutiques), difficilement analysable en RPLC. La seconde convient à une gamme plus large d'analytes, dont en particulier les composés très lipophiles (lipides, vitamines liposolubles...) difficiles à éluer en RPLC classique.
Enfin, Le dernier axe de développement est plus spécifique du domaine pharmaceutique et concerne l'analyse de protéines et anticorps monoclonaux thérapeutiques ayant des masses molaires comprises entre 5 et 150 kDa. Pour ce type d'analyse, les techniques historiques, telles que la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et la chromatographie d'échange d'ions (IEX) sont désormais fortement concurrencées par les nouveaux supports chromatographiques à large taille de pores disponibles en RPLC et offrant une meilleure compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).
Le but de cet article est d'exposer les évolutions majeures de la chromatographie liquide, afin que les utilisateurs puissent appliquer ces nouvelles méthodologies dans leurs laboratoires respectifs. Pour la théorie et les différents méthodes, se reporter aux articles [P 1 445] et [P 1 455].
KEYWORDS
HPLC | UHPLC | HILIC | SFC
DOI (Digital Object Identifier)
CET ARTICLE SE TROUVE ÉGALEMENT DANS :
Accueil > Ressources documentaires > Biomédical - Pharma > Médicaments et produits pharmaceutiques > Chimie pharmaceutique > Évolutions majeures en chromatographie liquide > Analyse de protéines thérapeutiques par RPLC
Cet article fait partie de l’offre
Techniques d'analyse
(286 articles en ce moment)
Cette offre vous donne accès à :
Une base complète d’articles
Actualisée et enrichie d’articles validés par nos comités scientifiques
Des services
Un ensemble d'outils exclusifs en complément des ressources
Un Parcours Pratique
Opérationnel et didactique, pour garantir l'acquisition des compétences transverses
Doc & Quiz
Des articles interactifs avec des quiz, pour une lecture constructive
Présentation
3. Analyse de protéines thérapeutiques par RPLC
3.1 Caractérisation des protéines thérapeutiques
Dans le domaine pharmaceutique, les molécules issues de sources biologiques ont de plus en plus tendance à remplacer les petites molécules (masse molaire < 500 g/mol) issues de la chimie de synthèse et traditionnellement utilisées comme médicaments. Ces produits issus de la biotechnologie pharmaceutique sont également connus sous le nom de « biopharmaceutiques » et incluent en particulier les protéines recombinantes.
Les protéines thérapeutiques sont difficiles à caractériser car les autorités demandent un grand nombre de vérifications (séquence primaire, modifications post-traductionnelle, caractérisation de l'agrégation...) qui doivent être souvent confirmées par deux méthodes analytiques orthogonales. De plus, les protéines souffrent de façon intrinsèque d'un problème de micro-hétérogénéité apparaissant au cours de leur fabrication, ce qui fait qu'en plus de l'isoforme principale, on observe aussi d'autres isoformes, dans lesquelles la séquence d'acides aminés a été altérée, et possédant des différences de taille ou de charge plus ou moins prononcées.
La figure 10 résume les principales techniques séparatives de caractérisation de protéines thérapeutiques. L'électrophorèse au format capillaire ou sur gel reste une technique de référence pour la caractérisation de protéines mais ne sera pas discutée ici. Au sein des techniques chromatographiques, la chromatographie d'échange d'ions IEX et la chromatographie d'exclusion de taille SEC sont des techniques historiques et restent aujourd'hui encore très utilisées pour la caractérisation de l'hétérogénéité de charge et de taille, respectivement. Cependant, elles souffrent de performances cinétiques faibles (les pics obtenus sont très larges), dues à des interactions aux cinétiques lentes (pour l'IEX) ou à l'absence d'interactions (pour la SEC). De plus, les phases mobiles employées contiennent de fortes proportions de sels non volatils et ne sont donc pas compatibles avec la MS, ce qui limite leur domaine d'application ...
Cet article fait partie de l’offre
Techniques d'analyse
(286 articles en ce moment)
Cette offre vous donne accès à :
Une base complète d’articles
Actualisée et enrichie d’articles validés par nos comités scientifiques
Des services
Un ensemble d'outils exclusifs en complément des ressources
Un Parcours Pratique
Opérationnel et didactique, pour garantir l'acquisition des compétences transverses
Doc & Quiz
Des articles interactifs avec des quiz, pour une lecture constructive
Analyse de protéines thérapeutiques par RPLC
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - HEINISCH (S.), ROCCA (J.L.) - Sense and nonsense of high-temperature liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1216, p. 642-658 (2009).
-
(2) - GUILLARME (D.), HEINISCH (S.), ROCCA (J.L.) - Effect of temperature in reversed phase liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1052, p. 39-51 (2004).
-
(3) - NGUYEN (D.T.T.), GUILLARME (D.), HEINISCH (S.), BARRIOULET (M.P.), ROCCA (J.L.), RUDAZ (S.), VEUTHEY (J.L.) - High throughput liquid chromatography with sub-2 mm particles at very high pressure and high temperature. - Journal of Chromatography A, 1167, p. 76-84 (2007).
-
(4) - GUIOCHON (G.) - Monolithic columns in high-performance liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1168, p. 101-168 (2007).
-
(5) - CABRERA (K.) - Applications of silica-based monolithic HPLC columns. - Journal of Separation Science, 27, p. 843-852 (2004).
-
(6)...
DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Congrès annuel HPLC http://www.hplc2014.org/
Congrès bi-annuel ISC http://www.isc2014.at/
Congrès bi-annuel HTC http://www.htc-conference.org/
HAUT DE PAGE2.1 Constructeurs – Fournisseurs – Distributeurs (liste non exhaustive)
Waters http://www.waters.com
Agilent technologies http://www.agilent.com
Shimadzu http://www.shimadzu.com
Thermo Scientific http://www.thermoscientific.com
HAUT DE PAGE2.2 Organismes – Fédérations – Associations (liste non exhaustive)
Association francophone des sciences séparatives,...
Cet article fait partie de l’offre
Techniques d'analyse
(286 articles en ce moment)
Cette offre vous donne accès à :
Une base complète d’articles
Actualisée et enrichie d’articles validés par nos comités scientifiques
Des services
Un ensemble d'outils exclusifs en complément des ressources
Un Parcours Pratique
Opérationnel et didactique, pour garantir l'acquisition des compétences transverses
Doc & Quiz
Des articles interactifs avec des quiz, pour une lecture constructive