Analyse de protéines thérapeutiques par RPLC
Évolutions majeures en chromatographie liquide

La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique clé, utilisée dans de nombreux secteurs d'activité, pour l'analyse de matrices agroalimentaires, environnementales et pharmaceutiques. Cette technique séparative peut être utilisée aussi bien pour des analyses purement qualitatives, que pour des applications quantitatives. Durant ces dernières années, les technologies employées en HPLC (phases stationnaires, phases mobiles, instrumentation...) ont évolué de manière très rapide, afin de répondre à certaines exigences des utilisateurs. Trois axes principaux d'amélioration ont été suivis.

Le premier axe de développement de l'HPLC est l'augmentation du débit d'analyse, afin d'obtenir des séparations cinq à dix fois plus rapides qu'auparavant, ainsi que la possibilité d'atteindre des séparations à plus haut pouvoir de séparation (à haute résolution). Pour cela, il est possible d'utiliser des supports chromatographiques innovants tels que les colonnes monolithiques, les colonnes remplies de particules poreuses de moins de 2 μm ou les colonnes remplies de particules superficiellement poreuses de moins de 3 μm. Il est également important de garder en tête qu'une augmentation de la température de la phase mobile permet une amélioration significative des performances chromatographiques. Cependant, afin de tirer tous les bénéfices de la chromatographie rapide et/ou à haute résolution, une instrumentation adaptée est nécessaire et des développements importants ont été réalisés dans ce sens au cours des dix dernières années.

Un autre axe de développement concerne l'utilisation de modes alternatifs de chromatographie. En effet, la chromatographie liquide à polarité des phases inversées (RPLC) est de loin la plus utilisée aujourd'hui mais il peut être intéressant d'avoir recours à des modes de séparations alternatifs pour moduler les sélectivités et rétentions de certains composés problématiques. Deux modes peuvent avoir de l'intérêt, il s'agit de la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et de la chromatographie supercritique (SFC). La première de ces deux approches est particulièrement adaptée à l'analyse de composés très hydrophiles (sucres, acides aminés) et/ou ionisables (molécules pharmaceutiques), difficilement analysable en RPLC. La seconde convient à une gamme plus large d'analytes, dont en particulier les composés très lipophiles (lipides, vitamines liposolubles...) difficiles à éluer en RPLC classique.

Enfin, Le dernier axe de développement est plus spécifique du domaine pharmaceutique et concerne l'analyse de protéines et anticorps monoclonaux thérapeutiques ayant des masses molaires comprises entre 5 et 150 kDa. Pour ce type d'analyse, les techniques historiques, telles que la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et la chromatographie d'échange d'ions (IEX) sont désormais fortement concurrencées par les nouveaux supports chromatographiques à large taille de pores disponibles en RPLC et offrant une meilleure compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).

Le but de cet article est d'exposer les évolutions majeures de la chromatographie liquide, afin que les utilisateurs puissent appliquer ces nouvelles méthodologies dans leurs laboratoires respectifs. Pour la théorie et les différents méthodes, se reporter aux articles [P 1 445] et [P 1 455].