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RÉSUMÉ
La chromatographie en phase liquide HPLC est une technique analytique employée dans de nombreux secteurs d'activité. Des solutions innovantes en termes de phases stationnaires et d'instruments sont apparues afin d'en augmenter la productivité. En parallèle, des stratégies orthogonales permettant de modifier la sélectivité et la rétention se sont développées. Enfin, cette technique s'est aussi adaptée à la caractérisation de protéines thérapeutiques, en plein essor dans le domaine pharmaceutique.
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High performance liquid chromatography (HPLC) is an analytical technique suitable for a large variety of applications. Some innovative solutions, in terms of stationary phases and instrumentation, were introduced to improve productivity. In parallel, some alternative strategies allowing severe modifications of selectivity and retention were also developed. Finally, this approach was also adapted for the characterisation of therapeutic proteins, which is currently a hot topic in the pharmaceutical industry
Auteur(s)
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Davy GUILLARME : Chargé d'enseignement Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, École des Sciences pharmaceutiques, Université de Genève
INTRODUCTION
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique clé, utilisée dans de nombreux secteurs d'activité, pour l'analyse de matrices agroalimentaires, environnementales et pharmaceutiques. Cette technique séparative peut être utilisée aussi bien pour des analyses purement qualitatives, que pour des applications quantitatives. Durant ces dernières années, les technologies employées en HPLC (phases stationnaires, phases mobiles, instrumentation...) ont évolué de manière très rapide, afin de répondre à certaines exigences des utilisateurs. Trois axes principaux d'amélioration ont été suivis.
Le premier axe de développement de l'HPLC est l'augmentation du débit d'analyse, afin d'obtenir des séparations cinq à dix fois plus rapides qu'auparavant, ainsi que la possibilité d'atteindre des séparations à plus haut pouvoir de séparation (à haute résolution). Pour cela, il est possible d'utiliser des supports chromatographiques innovants tels que les colonnes monolithiques, les colonnes remplies de particules poreuses de moins de 2 μm ou les colonnes remplies de particules superficiellement poreuses de moins de 3 μm. Il est également important de garder en tête qu'une augmentation de la température de la phase mobile permet une amélioration significative des performances chromatographiques. Cependant, afin de tirer tous les bénéfices de la chromatographie rapide et/ou à haute résolution, une instrumentation adaptée est nécessaire et des développements importants ont été réalisés dans ce sens au cours des dix dernières années.
Un autre axe de développement concerne l'utilisation de modes alternatifs de chromatographie. En effet, la chromatographie liquide à polarité des phases inversées (RPLC) est de loin la plus utilisée aujourd'hui mais il peut être intéressant d'avoir recours à des modes de séparations alternatifs pour moduler les sélectivités et rétentions de certains composés problématiques. Deux modes peuvent avoir de l'intérêt, il s'agit de la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et de la chromatographie supercritique (SFC). La première de ces deux approches est particulièrement adaptée à l'analyse de composés très hydrophiles (sucres, acides aminés) et/ou ionisables (molécules pharmaceutiques), difficilement analysable en RPLC. La seconde convient à une gamme plus large d'analytes, dont en particulier les composés très lipophiles (lipides, vitamines liposolubles...) difficiles à éluer en RPLC classique.
Enfin, Le dernier axe de développement est plus spécifique du domaine pharmaceutique et concerne l'analyse de protéines et anticorps monoclonaux thérapeutiques ayant des masses molaires comprises entre 5 et 150 kDa. Pour ce type d'analyse, les techniques historiques, telles que la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et la chromatographie d'échange d'ions (IEX) sont désormais fortement concurrencées par les nouveaux supports chromatographiques à large taille de pores disponibles en RPLC et offrant une meilleure compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).
Le but de cet article est d'exposer les évolutions majeures de la chromatographie liquide, afin que les utilisateurs puissent appliquer ces nouvelles méthodologies dans leurs laboratoires respectifs. Pour la théorie et les différents méthodes, se reporter aux articles [P 1 445] et [P 1 455].
KEYWORDS
HPLC | UHPLC | HILIC | SFC
DOI (Digital Object Identifier)
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1. Analyse rapide ou à haute résolution en chromatographie
1.1 Différentes stratégies
La chromatographie en phase liquide est une technique bien établie permettant l'analyse d'un grand nombre de substances dans des domaines divers et variés.
À titre d'exemple, l'HPLC peut être utilisée pour la détermination de résidus de pesticides dans des fruits et légumes, la caractérisation précise d'un échantillon de thé afin d'en déterminer le contenu en polyphénols, la détermination de substances prohibées (diurétiques, bétabloquants, stimulants...) dans des urines de sportifs, ou encore le contrôle qualité de médicaments.
Cependant, les temps d'analyse obtenus en HPLC avec une colonne classique de 150 mm × 4,6 mm, 5 μm peuvent parfois être relativement longs (en moyenne, une analyse dure entre 30 et 60 min) et dans certains cas, le pouvoir de séparation d'une telle colonne peut s'avérer trop limité pour la caractérisation d'échantillons complexes. Comme décrit ci-dessous, diverses approches ont été développées afin de pouvoir analyser un plus grand nombre d'échantillons dans le temps imparti ou pour augmenter de façon significative le nombre de composés pouvant être séparés par unité de temps.
Il y a en effet une demande croissante pour des analyses plus rapides en HPLC. Cela est particulièrement vrai dans certains domaines tels que la toxicologie forensique et clinique, les analyses antidopage ou encore l'analyse environnementale, pour lesquels les temps de réponse doivent être minimisés. Excepté ces domaines particuliers, l'industrie pharmaceutique est également très intéressée par les hauts débits d'analyse, puisque l'HPLC y est largement utilisée et il y a une véritable course à la productivité et à la réduction des coûts dans ce domaine. En effet, à cause du grand nombre d'échantillons qu'il est nécessaire d'analyser pour les applications pharmaceutiques classiques telles que les contrôles de pureté ou les études pharmacocinétiques, des analyses rapides (< 5 min) ou ultrarapides (< 1 min) sont nécessaires.
Les analyses à très haute résolution sont quant à elles utiles dans des domaines tels que la métabolomique humaine, la protéomique ou l'analyse d'extraits de plantes pour lesquels les matrices sont très complexes (fluides biologiques, produits naturels) et nécessitent un haut pouvoir de séparation.
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Analyse rapide ou à haute résolution en chromatographie
BIBLIOGRAPHIE
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(5) - CABRERA (K.) - Applications of silica-based monolithic HPLC columns. - Journal of Separation Science, 27, p. 843-852 (2004).
-
(6)...
DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Congrès annuel HPLC http://www.hplc2014.org/
Congrès bi-annuel ISC http://www.isc2014.at/
Congrès bi-annuel HTC http://www.htc-conference.org/
HAUT DE PAGE2.1 Constructeurs – Fournisseurs – Distributeurs (liste non exhaustive)
Waters http://www.waters.com
Agilent technologies http://www.agilent.com
Shimadzu http://www.shimadzu.com
Thermo Scientific http://www.thermoscientific.com
HAUT DE PAGE2.2 Organismes – Fédérations – Associations (liste non exhaustive)
Association francophone des sciences séparatives,...
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