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RÉSUMÉ
Les protéines recombinantes sont produites par des cellules dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique. Le système d'expression utilisé peut être de plusieurs types, organisme unicellulaire (procaryote ou eucaryote) ou pluricellulaire (plantes et animaux transgéniques). Malgré de fortes concentrations de protéines produites et de faibles contraintes de mise en œuvre, les systèmes d'expression bactériens n'autorisent pas les modifications posttraductionnelles et la glycosylation. Par contre, les cellules de mammifère se sont progressivement imposées comme les hôtes d'expression de choix pour la production de protéines recombinantes complexes d'intérêt thérapeutique. La description des mécanismes cellulaires impliqués dans la glycosylation des protéines, des différents modes de production ainsi que du choix des paramètres opératoires représente un socle de connaissances essentielles à la mise en œuvre de nouveaux procédés de production.
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Recombinant proteins are produced by cells the DNA of which has been modified by genetic recombination. The expression system involved can be single-cell (procaryotic or eucaryotic) or pluricellular organisms (transgenic plants and animals). Despite high concentrations of produced proteins and low implementation constraints, bacterial expression systems do not allow for post-translational modification and glycosylation. However, mammalian cells have gradually become the most favored expression systems in order to achieve the production of complex recombinant proteins of therapeutic interest. Sound knowledge of the cellular mechanisms involved in protein glycosylation, various production modes as well as in the choice of operating parameters is essential in order to achieve the implementation of new production processes.
Auteur(s)
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Jean-Louis GOERGEN : Professeur à l'Institut national polytechnique de Lorraine (INPL) - École nationale supérieure d'agronomie et des industries alimentaires (ENSAIA)
-
Emmanuel GUEDON : Chargé de recherche CNRS - Laboratoire réactions et génie des procédés (LRGP)
-
Marie-Françoise CLINCKE : Doctorante à l'Institut national polytechnique de Lorraine (INPL)
INTRODUCTION
En 2009, plus de 150 protéines recombinantes, dites « biopharmaceutiques », ont obtenu une autorisation de mise sur le marché délivrée par la Food and Drug Administration (FDA) et l'European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA). Parmi ces protéines, 76 ont été produites à partir de cellules de mammifère. Nonobstant des concentrations de protéines produites largement supérieures et des contraintes de mise en œuvre beaucoup moins importantes, les systèmes d'expression bactériens n'autorisent pas les modifications posttraductionnelles (MPT) complexes, contrairement aux cellules animales et de mammifère en particulier. Parmi ces MPT, la glycosylation est la plus importante ; elle est présente sur plus de 50 % des protéines chez l'homme et confère aux protéines qui les portent des propriétés fonctionnelles, structurales et pharmaco-cinétiques. Alors que la glycosylation n'est pas assurée avec les systèmes bactériens ou l'est partiellement par les levures ou les cellules d'insecte, les cellules de mammifère et plus particulièrement la cellule CHO se sont progressivement imposées comme les hôtes d'expression de choix pour la production de protéines recombinantes complexes d'intérêt thérapeutique. Outre la glycosylation, la production de protéines par ce système cellulaire présente l'avantage de pouvoir généralement assurer d'autres MPT importantes, parmi lesquelles la sulfatation ou encore la protéolyse.
L'objectif de cet article est de décrire, après quelques généralités, les différents systèmes cellulaires utilisés par l'industrie des biotechnologies ainsi que les principales caractéristiques qualitatives des protéines recombinantes. L'accent est tout particulièrement porté sur les modifications posttraductionnelles et en premier lieu la glycosylation. La description des mécanismes cellulaires impliqués dans la glycosylation des protéines, des différents modes de production ainsi que du choix des paramètres opératoires représente un socle de connaissances essentielles à la mise en œuvre de nouveaux procédés de production ou à l'amélioration ciblée de procédés déjà existants.
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N-glycosylation des protéines dans les cellules animales
En anglais
2. Aspects qualitatifs des protéines recombinantes
2.1 Modifications posttraductionnelles
Les modifications posttraductionnelles (MPT) incluent l'agrégation des protéines, l'oxydation des méthionines, la désamination de l'asparagine et dans une moindre mesure celle de la glutamine, l'ajout de lipides, la protéolyse, la γ-carboxylation, la glycosylation et la sulfatation des protéines .
De telles modifications ne représentent pas uniquement un challenge au niveau des procédés de production mais peuvent avant tout avoir des conséquences indésirables pour le patient. En effet, des MPT incorrectes peuvent réduire l'efficacité de la protéine mais également entraîner une réaction du système immunitaire. Les MPT telles que l'agrégation des protéines, la désamination de l'asparagine et l'isomérisation de l'acide aspartique, l'oxydation des méthionines et la sulfatation sont décrites succinctement dans ce chapitre. De telles modifications ne sont pas souhaitées pour les protéines à visée thérapeutique. Cependant, dans le domaine des bioprocédés, très peu d'études traitent de ces MPT.
De nombreuses protéines recombinantes ne sont pas produites dans leur état tridimensionnel natif, et s'agrègent dans un état biologiquement inactif, encore appelé « corps d'inclusion » dans le cas des systèmes bactériens. Ce phénomène d'agrégation des protéines est un terme général qui englobe plusieurs types d'interactions ou caractéristiques. Cette modification de la protéine peut provenir de différents mécanismes et être classifiée de différentes façons, à savoir soluble/insoluble, covalente/non covalente, réversible/non réversible et native/dénaturée.
L'une des premières étapes dans le phénomène d'agrégation des protéines est la formation de liaisons faibles, autrement dit d'interactions non covalentes, entre les protéines. L'exposition de ces protéines partiellement dénaturées à des surfaces hydrophobes peut conduire à des agrégations...
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Aspects qualitatifs des protéines recombinantes
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - BANEYX (F.), MUJACIC (M.) - Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. - Nat. Biotechnol., no 22, p. 1399-1407 (2004).
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Genzyme France http://www.genzyme.fr/
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GTC Biotherapeutics http://www.gtc-bio.com
Hoffmann-La Roche http://www.roche.fr
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Laboratoire français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) http://www.lfb.fr
Merk et Co http://www.merck.com
Plant Advanced Technologies (PAT SA) http://www.plantadvanced.com/
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