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RÉSUMÉ
La chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC) est une méthode d’analyse à très haut pouvoir de séparation. Elle combine deux séparations basées sur des mécanismes orthogonaux lui permettant d’accéder à un degré d’information bien supérieur à celui obtenu par chromatographie unidimensionnelle classique (1D-LC). Cet article détaille les différents modes de 2D-LC qui peuvent être envisagés selon la problématique tout en illustrant leur intérêt par rapport à une approche 1D-LC. Les éléments clés du développement de méthode en 2D-LC en ligne sont abordés avant d’illustrer le potentiel de cette technique par des exemples d’applications relatifs à de nombreux secteurs.
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Lire l’articleAuteur(s)
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Sabine HEINISCH : Ingénieur de recherche, Responsable d’équipe de recherche à l’Institut des sciences analytiques Université de Lyon, Institut des sciences analytiques, CNRS, UMR5280, 69100 Villeurbanne, France
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Morgan SARRUT : Responsable de laboratoire Solvay, Centre de recherche et innovation, 69190 Saint-Fons, France
INTRODUCTION
La chromatographie liquide (LC) est une technique analytique de choix dans de nombreux domaines (se reporter aux articles [P 1 655] [P 1 494] et [P 1 460]). En effet, les différents modes LC (RPLC, IEX, SEC, HIC, HILIC, etc.) permettent d’adapter le pouvoir de séparation aux propriétés physico-chimiques des molécules à analyser. Toutefois, le besoin croissant de caractérisation fine de milieux complexes associé aux exigences réglementaires toujours plus poussées requiert un pouvoir de séparation (ou capacité de pics) que ne peut pas atteindre la LC unidimensionnelle (1D-LC). Cela malgré l’utilisation de systèmes à ultra-haute pression (1 200 à 1 500 bar) associés à des colonnes équipées de diamètre de particules inférieur à 2 μm (UHPLC). La chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC) permet de répondre à ces enjeux. En effet, la 2D-LC combine deux dimensions de séparations complémentaires, ce qui accroît l’espace de séparation et donc le pouvoir de résolution global. De plus, ajouter une deuxième séparation chromatographique rend plus facilement accessible le couplage à la spectrométrie de masse à des modes de chromatographie incompatibles ou difficilement compatibles (IEX, HIC, NPLC, etc.) permettant l’accès à une dimension d’information supplémentaire. Ce même raisonnement s’applique pour des méthodes existantes, qui peuvent difficilement être modifiées (cas de méthodes pharmaceutiques).
Cet article expose le principe de la 2D-LC, les différentes approches envisageables (ciblées/non ciblées, hors ligne/en ligne) et définit des critères de choix quant à son utilisation par rapport à une méthode 1D-LC. Les paramètres clés pour le développement de méthodes en 2D-LC sont décrits en se focalisant sur le mode 2D-LC « comprehensive » en ligne qui est la technique à plus fort potentiel mais dont le développement de méthodes demeure complexe. Enfin, plusieurs exemples d’applications sont présentés dans de nombreux domaines.
Comme il est d’usage dans la profession, les pourcentages indiqués sont, sauf précision contraire, volumiques.
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Quand préférer la LC×LC à la LC ?
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1. Principe de la chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC)
Le principe de la 2D-LC réside dans le fait que des fractions issues d’une première dimension (notée 1D) sont transférées vers une deuxième dimension (notée 2D) pour subir une deuxième séparation. Idéalement, les deux séparations sont complémentaires et apportent ainsi des sélectivités différentes aux composés à séparer.
1.1 Différents modes de 2D-LC
Il existe deux grands modes en 2D-LC. Le premier est dit « coupe à cœur » (heart-cut) dénoté LC-LC, tandis que le second mode est dit « intégral » (comprehensive) dénoté LC×LC. Pour faciliter le lien avec la littérature en langue anglaise, les termes heart-cut et comprehensive sont utilisés dans la suite de cet article. La figure 1 illustre ces deux modes. Le tableau 1 résume leurs avantages et leurs inconvénients.
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Le mode heart-cut noté LC-LC (figure 1 a ) consiste en l’injection dans la seconde dimension d’une plage d’élution relativement large (au moins une largeur de pic) d’une ou plusieurs portions du chromatogramme de première dimension. Lorsque plusieurs portions (ou fractions) sont injectées, on parle de heart-cut multiples noté mLC-LC (figure 1 b ).
Le mode heart-cut peut être utilisé pour améliorer en 2D la séparation d’une paire de pics donnée, insuffisamment séparée en 1D. Il est très souvent utilisé pour éliminer la matrice et ainsi isoler des composés d’intérêt avant de les envoyer dans un spectromètre de masse. Il est exclusivement dédié à des approches ciblées.
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Principe de la chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC)
BIBLIOGRAPHIE
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(1) - GROSKREUTZ (S.R.), SWENSON (M.M.), SECOR (L.B.), STOLL (D.R.) - Selective comprehensive multidimensional separation for resolution enhancement in high performance liquid chromatography. - Part II : Applications, Journal of Chromatography A (2011) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2011.06.038
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(2) - GUIOCHON (G.), MARCHETTI (N.), MRIZIQ (K.), SHALLIKER (R.A.) - Implementations of two-dimensional liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1189, p. 109-168 (2008) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.01.086
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(3) - BEDANI (F.), SCHOENMAKERS (P.J.), JANSSEN (H.-G.) - Theories to support method development in comprehensive two-dimensional liquid chromatography – A review. - Journal of Separation Science, 35, p. 1697-1711 (2012) https://doi.org/10.1002/jssc.201200070
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(4) - EHKIRCH (A.), GOYON (A.), HERNANDEZ-ALBA (O.), ROUVIERE (F.), D’ATRI (V.), DREYFUS (C.), HAEUW (J.-F.), DIEMER (H.), BECK (A.), HEINISCH (S.), GUILLARME (D.), CIANFERANI (S.) - A Novel online four-dimensional SECxSEC-IMxMS methodology for characterization of monoclonal antibody size variants. - Anal. Chem., 90, p. 13929-13937 (2018) https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b03333
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DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Série de congrès bi-annuel « International Symposium on Chromatography » (ISC) qui se déroule en Europe
Série de congrès « HPLC and related techniques » qui se déroule tous les ans alternativement aux États-Unis et en Europe
Série de congrès bi-annuel « Hyphenated techniques in chromatography (HTC) » qui se déroule en Europe
Série de congrès bi-annuel « SEP » qui se déroule à Paris tous les deux ans (congrès francophone)
HAUT DE PAGE2.1 Principaux fournisseurs (liste non exhaustive)
Agilent technologies http://www.agilent.com
Waters https://waters.com
Shimadzu https://shimadzu.fr
HAUT DE PAGE2.2 Associations (liste non exhaustive)
Association francophone des sciences séparatives ASFEP https://www.afsep.com
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