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RÉSUMÉ
La chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC) est une méthode d’analyse à très haut pouvoir de séparation. Elle combine deux séparations basées sur des mécanismes orthogonaux lui permettant d’accéder à un degré d’information bien supérieur à celui obtenu par chromatographie unidimensionnelle classique (1D-LC). Cet article détaille les différents modes de 2D-LC qui peuvent être envisagés selon la problématique tout en illustrant leur intérêt par rapport à une approche 1D-LC. Les éléments clés du développement de méthode en 2D-LC en ligne sont abordés avant d’illustrer le potentiel de cette technique par des exemples d’applications relatifs à de nombreux secteurs.
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Lire l’articleAuteur(s)
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Sabine HEINISCH : Ingénieur de recherche, Responsable d’équipe de recherche à l’Institut des sciences analytiques Université de Lyon, Institut des sciences analytiques, CNRS, UMR5280, 69100 Villeurbanne, France
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Morgan SARRUT : Responsable de laboratoire Solvay, Centre de recherche et innovation, 69190 Saint-Fons, France
INTRODUCTION
La chromatographie liquide (LC) est une technique analytique de choix dans de nombreux domaines (se reporter aux articles [P 1 655] [P 1 494] et [P 1 460]). En effet, les différents modes LC (RPLC, IEX, SEC, HIC, HILIC, etc.) permettent d’adapter le pouvoir de séparation aux propriétés physico-chimiques des molécules à analyser. Toutefois, le besoin croissant de caractérisation fine de milieux complexes associé aux exigences réglementaires toujours plus poussées requiert un pouvoir de séparation (ou capacité de pics) que ne peut pas atteindre la LC unidimensionnelle (1D-LC). Cela malgré l’utilisation de systèmes à ultra-haute pression (1 200 à 1 500 bar) associés à des colonnes équipées de diamètre de particules inférieur à 2 μm (UHPLC). La chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC) permet de répondre à ces enjeux. En effet, la 2D-LC combine deux dimensions de séparations complémentaires, ce qui accroît l’espace de séparation et donc le pouvoir de résolution global. De plus, ajouter une deuxième séparation chromatographique rend plus facilement accessible le couplage à la spectrométrie de masse à des modes de chromatographie incompatibles ou difficilement compatibles (IEX, HIC, NPLC, etc.) permettant l’accès à une dimension d’information supplémentaire. Ce même raisonnement s’applique pour des méthodes existantes, qui peuvent difficilement être modifiées (cas de méthodes pharmaceutiques).
Cet article expose le principe de la 2D-LC, les différentes approches envisageables (ciblées/non ciblées, hors ligne/en ligne) et définit des critères de choix quant à son utilisation par rapport à une méthode 1D-LC. Les paramètres clés pour le développement de méthodes en 2D-LC sont décrits en se focalisant sur le mode 2D-LC « comprehensive » en ligne qui est la technique à plus fort potentiel mais dont le développement de méthodes demeure complexe. Enfin, plusieurs exemples d’applications sont présentés dans de nombreux domaines.
Comme il est d’usage dans la profession, les pourcentages indiqués sont, sauf précision contraire, volumiques.
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Applications en 2D-LC
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3. Développement de méthodes en LC×LC
Que ce soit hors ligne ou en ligne, il est nécessaire de trouver une combinaison LC×LC suffisamment orthogonale. En LC×LC hors ligne, les deux dimensions peuvent être ensuite optimisées indépendamment l’une de l’autre, le développement de méthodes étant celui qu’on utilise classiquement en LC. En LC×LC en ligne, le développement est plus compliqué car les deux dimensions sont liées et doivent, par conséquent, être optimisées simultanément.
3.1 Recherche d’orthogonalité entre les deux dimensions
La première étape du développement de méthode en LC×LC consiste à sélectionner deux systèmes chromatographiques (figure 4) offrant un degré d’orthogonalité suffisant. Le taux d’occupation de l’espace de séparation γ est un premier critère pour évaluer le degré d’orthogonalité. Le second critère dépend de la variation de log k en fonction de la composition de la phase mobile dans chacune des deux dimensions, k étant le facteur de rétention du composé. Plus la variation est forte, plus le degré d’orthogonalité entre les deux dimensions est élevé . Enfin, un troisième critère est l’espace de séparation lui-même qui doit être le plus large possible. Il dépend des domaines de compositions (composition initiale à composition finale) balayés par les gradients d’élution dans les deux dimensions.
La recherche des deux systèmes chromatographiques peut être effectuée soit à partir de composés...
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Développement de méthodes en LC×LC
BIBLIOGRAPHIE
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(1) - GROSKREUTZ (S.R.), SWENSON (M.M.), SECOR (L.B.), STOLL (D.R.) - Selective comprehensive multidimensional separation for resolution enhancement in high performance liquid chromatography. - Part II : Applications, Journal of Chromatography A (2011) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2011.06.038
-
(2) - GUIOCHON (G.), MARCHETTI (N.), MRIZIQ (K.), SHALLIKER (R.A.) - Implementations of two-dimensional liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1189, p. 109-168 (2008) https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.01.086
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(3) - BEDANI (F.), SCHOENMAKERS (P.J.), JANSSEN (H.-G.) - Theories to support method development in comprehensive two-dimensional liquid chromatography – A review. - Journal of Separation Science, 35, p. 1697-1711 (2012) https://doi.org/10.1002/jssc.201200070
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(4) - EHKIRCH (A.), GOYON (A.), HERNANDEZ-ALBA (O.), ROUVIERE (F.), D’ATRI (V.), DREYFUS (C.), HAEUW (J.-F.), DIEMER (H.), BECK (A.), HEINISCH (S.), GUILLARME (D.), CIANFERANI (S.) - A Novel online four-dimensional SECxSEC-IMxMS methodology for characterization of monoclonal antibody size variants. - Anal. Chem., 90, p. 13929-13937 (2018) https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b03333
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DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Série de congrès bi-annuel « International Symposium on Chromatography » (ISC) qui se déroule en Europe
Série de congrès « HPLC and related techniques » qui se déroule tous les ans alternativement aux États-Unis et en Europe
Série de congrès bi-annuel « Hyphenated techniques in chromatography (HTC) » qui se déroule en Europe
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HAUT DE PAGE2.1 Principaux fournisseurs (liste non exhaustive)
Agilent technologies http://www.agilent.com
Waters https://waters.com
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HAUT DE PAGE2.2 Associations (liste non exhaustive)
Association francophone des sciences séparatives ASFEP https://www.afsep.com
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