Bibliographie & annexes
Présentation
En anglais
RÉSUMÉ
Les progrès réalisés dans les domaines de la génétique, de la biochimie et de la biophysique ont permis de déterminer la structure et le fonctionnement des enzymes, d’améliorer leur production et de développer des tests innovants. Les mesures d’activité ou d’affinité enzymatiques sont plus performantes et écologiques. Cet article présente des techniques couramment utilisées dont l’amélioration a été accompagnée de la miniaturisation des essais. Des appareils avec divers systèmes de détection mesurent de très petites quantités de substrat ou de produit lors d’une réaction enzymatique, permettant une accélération de l’efficacité des recherches avec des gains de temps et financiers précieux.
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Advances in the fields of genetics, biochemistry and biophysics allowed to determine the structure and functioning of enzymes, to improve their production and to develop innovative tests. Measurements of enzymatic activity or affinity are more efficient and ecological. This article presents commonly used techniques whose improvement has been accompanied by the miniaturization of the tests. Devices with various detection systems measure very small quantities of substrate or product during an enzymatic reaction, allowing an acceleration of the efficiency of research with valuable time and financial savings.
Auteur(s)
-
Julien DUMOND : Docteur en virologie enzymologie - Consultant en entreprises pharmaceutiques, Metz, France
-
Serge KIRKIACHARIAN : Docteur ès sciences physiques, Pharmacien - Professeur émérite de chimie thérapeutique de la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’université Paris Sud - Praticien hospitalier chef de service honoraire des hôpitaux de Paris, France
INTRODUCTION
Depuis le début des années 1990, des progrès remarquables ont été réalisés dans de nombreux domaines scientifiques parmi lesquels il convient de citer :
-
la biologie moléculaire dans la connaissance des génomes, le clonage, les techniques expérimentales, l’élaboration et l’utilisation des vecteurs ;
-
la microbiologie avec la détermination de diverses souches d’hôtes et de milieux de culture ;
-
la biochimie avec la mise au point de colonnes en chromatographie ;
-
la biophysique avec le couplage possible entre la résonance plasmonique de surface ou l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel et la spectrométrie de masse permettant d’optimiser la production et la purification des protéines et des enzymes ;
-
la détermination accélérée de la structure spatiale des protéines et des enzymes faisant appel aux applications de l’intelligence artificielle.
Dès lors, l’accès à une meilleure connaissance des enzymes et l’optimisation de leur production et de leur purification sont devenus plus accessibles.
En parallèle, des améliorations ont été réalisées au niveau des tests de mesure d’activité enzymatique et des essais permettant de qualifier et de quantifier la liaison entre une enzyme et un effecteur.
Ces diverses techniques sont ainsi de plus en plus résolutives, fiables et écologiques. Elles ont permis d’accélérer les recherches notamment dans divers domaines thérapeutiques. Il convient de citer à titre d’exemple la rapidité remarquable du développement d’inhibiteurs de kinases en oncologie, en raison de la genèse rapide de molécules chimiques ou biologiques couplée à des essais sur cibles très résolutifs et également rapides. Alors qu’il y a une trentaine d’années, il n’existait pratiquement pas de projets de recherche thérapeutique ciblant ces enzymes, leur nombre est de nos jours si élevé, que l’accès à l’ensemble des médicaments mis sur le marché ciblant entre autres les kinases devient plus ardu. Dans ce contexte, cette revue propose une vue d’ensemble non exhaustive des techniques et des protocoles de purification et de mesure d’activité enzymatique.
Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des sigles et des notations utilisés.
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MOTS-CLÉS
techniques biochimiques et biophysiques tests d'activité enzymatique affinité miniaturisation des essais
KEYWORDS
biochemical and biophysical techniques | enzyme activity assays | affinity | assay miniaturization
DOI (Digital Object Identifier)
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Méthodes de détection et d’élaboration de substrats ou de kits très spécifiques
En anglais
1. Gains de productivité grâce à des techniques expérimentales performantes
1.1 Biologie moléculaire et microbiologie
La détermination de la totalité des séquences génétiques d’un nombre croissant d’organismes, des plus simples aux plus complexes, a permis les progrès rapides de la biologie moléculaire . Dans les années 1990, les premières séquences totales de génomes bactériens sont obtenues et, la décennie suivante, le génome humain est séquencé. Il faut noter depuis quelques années le développement de techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS pour New Generation Sequencing) ou séquençage haut débit. Parmi ces technologies, peuvent être citées Roche 454, Illumina® de Solexa, Ion Torrent™ : Proton/PGM. Ces techniques révolutionnent les études génomiques. La préparation des banques est générée par fragmentation aléatoire de l’ADN suivie de l’hybridation de petites sondes spécifiques. L’amplification s’effectue par des méthodes d’amplification clonale et PCR de plus en plus sophistiquées. Le séquençage est ainsi réalisé en utilisant différentes approches. Pour la technologie Illumina®, l’amplification clonale est réalisée suivie d’un séquençage SBS (séquençage par synthèse). Ce séquençage permet d’identifier instantanément les désoxyribonucléotides polymérisés dans la chaîne naissante grâce à des signaux de fluorescence spécifiques pour chaque base azotée. Cette méthode peut être utilisée pour séquencer en totalité ou en partie les génomes d’organismes variés.
La connaissance des génomes de bactéries, des plasmides qui les constituent, de vecteurs viraux, ainsi que des levures est très importante. En effet, ces entités sont à la base des systèmes de production in vitro de protéines humaines.
Le génome humain contient les séquences de gènes d’intérêt.
Pour les expériences de production d’une protéine recherchée, les...
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BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - GAILLARDIN (C.), TINSLEY (C.R.) - Génétique moléculaire. - AgroParisTech, Cursus Ingénieur Agronome, 1re année, Module de Biologie (2007).
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(2) - WURM (D.J.) et al - The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. - Appl. Microbiol. Biotechnol., 100(20), p. 8721-8729 (2016).
-
(3) - SHIMIZU (Y.) et al - Cell-free translation reconstituted with purified components. - Nature, 19, p. 751-755 (2001).
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(4) - DILWORTH (M.V.) et al - Microbial expression systems for membrane proteins. - Methods, S1046-2023(17), p. 30377-30378 (2018).
-
(5) - HOU (C.) et al - Weak anion and cation exchange mixed-bed microcolumn for protein separation. - J. Sep. Sci., 33(21), p. 3299-3303 (2010).
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