Bibliographie & annexes
Présentation
En anglais
RÉSUMÉ
Les progrès réalisés dans les domaines de la génétique, de la biochimie et de la biophysique ont permis de déterminer la structure et le fonctionnement des enzymes, d’améliorer leur production et de développer des tests innovants. Les mesures d’activité ou d’affinité enzymatiques sont plus performantes et écologiques. Cet article présente des techniques couramment utilisées dont l’amélioration a été accompagnée de la miniaturisation des essais. Des appareils avec divers systèmes de détection mesurent de très petites quantités de substrat ou de produit lors d’une réaction enzymatique, permettant une accélération de l’efficacité des recherches avec des gains de temps et financiers précieux.
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Advances in the fields of genetics, biochemistry and biophysics allowed to determine the structure and functioning of enzymes, to improve their production and to develop innovative tests. Measurements of enzymatic activity or affinity are more efficient and ecological. This article presents commonly used techniques whose improvement has been accompanied by the miniaturization of the tests. Devices with various detection systems measure very small quantities of substrate or product during an enzymatic reaction, allowing an acceleration of the efficiency of research with valuable time and financial savings.
Auteur(s)
-
Julien DUMOND : Docteur en virologie enzymologie - Consultant en entreprises pharmaceutiques, Metz, France
-
Serge KIRKIACHARIAN : Docteur ès sciences physiques, Pharmacien - Professeur émérite de chimie thérapeutique de la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’université Paris Sud - Praticien hospitalier chef de service honoraire des hôpitaux de Paris, France
INTRODUCTION
Depuis le début des années 1990, des progrès remarquables ont été réalisés dans de nombreux domaines scientifiques parmi lesquels il convient de citer :
-
la biologie moléculaire dans la connaissance des génomes, le clonage, les techniques expérimentales, l’élaboration et l’utilisation des vecteurs ;
-
la microbiologie avec la détermination de diverses souches d’hôtes et de milieux de culture ;
-
la biochimie avec la mise au point de colonnes en chromatographie ;
-
la biophysique avec le couplage possible entre la résonance plasmonique de surface ou l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel et la spectrométrie de masse permettant d’optimiser la production et la purification des protéines et des enzymes ;
-
la détermination accélérée de la structure spatiale des protéines et des enzymes faisant appel aux applications de l’intelligence artificielle.
Dès lors, l’accès à une meilleure connaissance des enzymes et l’optimisation de leur production et de leur purification sont devenus plus accessibles.
En parallèle, des améliorations ont été réalisées au niveau des tests de mesure d’activité enzymatique et des essais permettant de qualifier et de quantifier la liaison entre une enzyme et un effecteur.
Ces diverses techniques sont ainsi de plus en plus résolutives, fiables et écologiques. Elles ont permis d’accélérer les recherches notamment dans divers domaines thérapeutiques. Il convient de citer à titre d’exemple la rapidité remarquable du développement d’inhibiteurs de kinases en oncologie, en raison de la genèse rapide de molécules chimiques ou biologiques couplée à des essais sur cibles très résolutifs et également rapides. Alors qu’il y a une trentaine d’années, il n’existait pratiquement pas de projets de recherche thérapeutique ciblant ces enzymes, leur nombre est de nos jours si élevé, que l’accès à l’ensemble des médicaments mis sur le marché ciblant entre autres les kinases devient plus ardu. Dans ce contexte, cette revue propose une vue d’ensemble non exhaustive des techniques et des protocoles de purification et de mesure d’activité enzymatique.
Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des sigles et des notations utilisés.
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MOTS-CLÉS
techniques biochimiques et biophysiques tests d'activité enzymatique affinité miniaturisation des essais
KEYWORDS
biochemical and biophysical techniques | enzyme activity assays | affinity | assay miniaturization
DOI (Digital Object Identifier)
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Sigles et notations
En anglais
5. Glossaire
séquençage de nouvelle génération ; New generation sequencing (NGS)
Méthodologie moléculaire qui permet un séquençage rapide. La préparation des banques est générée par fragmentation aléatoire de l’ADN suivie de l’hybridation de petites sondes spécifiques. L’amplification s’effectue par des méthodes d’amplification clonale et PCR de plus en plus sophistiquées. Le séquençage peut être réalisé en utilisant différentes approches.
Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) ; High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Technique permettant de séparer les constituants d’un mélange. Une pompe injecte sous pression le ou les liquides (phase mobile) au niveau d’une colonne de chromatographie (phase stationnaire établie), qui retient les différentes molécules à séparer du mélange en fonction de leurs caractéristiques physicochimiques et des propriétés de la colonne utilisée. Pour éluer les composantes du mélange, le système peut être utilisé en mode isocratique (toujours la même phase mobile) ou en mode gradient (variation de la phase mobile en constituants et proportions sur la durée de l’expérience).
Chromatographie Liquide Ultra Performance (CLUP) ; Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)
Principe identique à celui de l’HPLC. Les expériences se font à plus fortes pressions et la séparation des constituants est plus résolutive.
spectrométrie de masse ; mass spectrometry
Technique permettant la détermination des masses moléculaires des composés analysés, ainsi que leur identification et leur quantification. Elle se fonde sur la séparation et la détection des ions formés à partir de la molécule étudiée dans la source d’ionisation ou la chambre de collision.
absorption ; absorption
Dans l’UV proche ou le visible, propriété d’une molécule à absorber un rayonnement à une longueur d’onde donnée et à n’en laisser passer qu’une fraction. La loi de Beer Lambert permet de relier l’intensité du faisceau transmis I (t) au faisceau incident I 0 afin de déduire l’absorbance.
fluorescence ; fluorescence
Propriété de la molécule à émettre...
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Glossaire
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - GAILLARDIN (C.), TINSLEY (C.R.) - Génétique moléculaire. - AgroParisTech, Cursus Ingénieur Agronome, 1re année, Module de Biologie (2007).
-
(2) - WURM (D.J.) et al - The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. - Appl. Microbiol. Biotechnol., 100(20), p. 8721-8729 (2016).
-
(3) - SHIMIZU (Y.) et al - Cell-free translation reconstituted with purified components. - Nature, 19, p. 751-755 (2001).
-
(4) - DILWORTH (M.V.) et al - Microbial expression systems for membrane proteins. - Methods, S1046-2023(17), p. 30377-30378 (2018).
-
(5) - HOU (C.) et al - Weak anion and cation exchange mixed-bed microcolumn for protein separation. - J. Sep. Sci., 33(21), p. 3299-3303 (2010).
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(6)...
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