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RÉSUMÉ
En électrophorèse capillaire, les composés sont analysés au sein d’un capillaire de quelques dizaines de micromètres de diamètre interne rempli d’un électrolyte. L’application d’un champ électrique entraîne la mise en mouvement des composés selon leur migration électrophorétique et l’écoulement électroosmotique. Cet article présente les différents paramètres qui influencent ces deux phénomènes, ainsi que les grandeurs fondamentales (temps de migration, mobilité, efficacité et résolution) qui caractérisent la séparation obtenue. Les différentes contributions à l’élargissement des pics sont décrites. Enfin, les différents modes de séparation sont présentés et illustrés par des applications.
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Nathalie DELAUNAY : Chercheur CNRS, Laboratoire de sciences analytiques, bioanalytiques et miniaturisation, UMR 8231 CBI, ESPCI Paris, France
INTRODUCTION
D’électrophorèse capillaire est une technique d’analyse de composés en phase liquide, que ceux-ci soient des petits ions inorganiques, des petites molécules telles que des acides aminés, des peptides ou des principes actifs pharmaceutiques, ou des macromolécules telles que des protéines, des polymères et de l’ADN, voire des nanoparticules ou des virus. Elle est mise en œuvre au sein d’un capillaire de faible diamètre interne (quelques dizaines de micromètres) rempli d’un électrolyte de séparation et requiert l’application d’un champ électrique. Comme la chromatographie en phase liquide, il existe plusieurs modes de séparation en fonction de la composition de l’électrolyte et de la présence éventuelle d’une phase stationnaire dans le capillaire, et qui permettent la séparation des composés en fonction de leur rapport charge sur taille, de leur hydrophobicité, de leur chiralité, de leur taille ou de leur point isoélectrique par exemple. Cette diversité de mécanismes de séparation, alliée à de très grandes efficacités, des analyses rapides, automatisées, peu coûteuses et miniaturisées rendent cette technique incontournable dans de nombreuses applications. Cet article présente les différents paramètres influant sur la séparation des composés, définit les grandeurs fondamentales et décrit les différents phénomènes pouvant conduire à une diminution des performances de l’analyse. Le principe de chaque mode de séparation en électrophorèse capillaire est présenté et illustré par des exemples d’application variés (ions inorganiques, médicaments, polluants, protéines, ADN…).
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- Version archivée 1 de déc. 2003 par Myriam TAVERNA, Isabelle LE POTIER, Philippe MORIN
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Principe des différents modes de séparation en électrophorèse capillaire
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3. Contributions à l’élargissement des pics
L’électrophorèse capillaire est une technique d’analyse réputée pour donner de grandes valeurs d’efficacité, supérieures à 104, voire 105. Cela provient du profil de vitesse plat de l’écoulement électroosmotique, qui minimise la dispersion d’une bande d’un composé donné le long du capillaire lors de son déplacement par rapport à un écoulement hydrodynamique parabolique comme observé en chromatographie en phase liquide. Cependant, plusieurs phénomènes peuvent rapidement contribuer à faire chuter l’efficacité et dégrader la forme des pics et l’allure de l’électrophorégramme. Ce paragraphe présente donc les phénomènes majeurs qui peuvent élargir et déformer les pics et les options permettant d’éviter ces travers en s’appuyant sur l’hypothèse que chaque composé est caractérisé par un pic ayant une forme gaussienne. Dans ce cas, la largeur du pic est caractérisée par l’écart-type σ, sachant que sa largeur à mi-hauteur est alors égale à 2(2ln(2))1/2 σ, soit environ 2,355σ, et sa variance σ 2. La variance totale du pic, notée σ 2, est la somme des variances des différents phénomènes qui contribuent à l’élargissement du pic.
3.1 Diffusion
La diffusion longitudinale lors du déplacement d’une zone d’un composé au sein du capillaire constitue une contribution majeure à l’élargissement de cette zone et donc du pic détecté. Elle est inévitable et, dans le cas idéal, c’est la seule source d’élargissement des pics en électrophorèse capillaire. Elle a pour origine le mouvement brownien des analytes et la force de traînée exercée par l’électrolyte liquide. Ainsi, la loi de Stokes-Einstein permet d’exprimer la variance
qui contribue à la variance totale σ 2 du pic par :
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BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - PORRAS (S.P.), RIEKKOLA (M.-L.), KENNDLER (E.) - The principles of migration and dispersion in capillary zone electrophoresis in nonaqueous solvents. - Electrophoresis, 24, p. 1485-1498 (2003).
-
(2) - FRIEDL (W.), REIJENGA (J.C.), KENNDLER (E.) - Ionic strength and charge number correction for mobilities of multivalent organic anions in capillary electrophoresis. - J. Chromatogr. A, 709, p. 163-170 (1995).
-
(3) - LUKACS (K.D.), JORGENSON (J.W.) - Capillary zone electrophoresis: effect of physical parameters on separation efficiency and quantitation. - J. High Res. Chromatog., 8, p. 407-411 (1985).
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(4) - TANDON (V.), BHAGAVATULA (S.K.), NELSON (W.C.), KIRBY (B.J.) - Zeta potential and electroosmotic mobility in microfluidic devices fabricated from hydrophobic polymers: 1. The origins of charge. - Electrophoresis, 29, p. 1092-1101 (2088).
-
(5) - SCHWER (C.), KENNDLER (E.) - Electrophoresis in fused-silica capillaries: the influence of organic solvents on the electroosmotic velocity and the z potential. - Anal....
DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
NORMES
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[IDF 206:2006] Lait en poudre – Détermination des protéines de soja et de pois par électrophorèse capillaire en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-CE) – Méthode de criblage - ISO 17129 - 2006
-
Formules infantiles en poudre à base de lait – Quantification de la teneur en protéine de lactosérum par électrophorèse capillaire sur gel contenant du dodécylsulfate de sodium (SDS-CGE) - ISO/DIS 23293 - 06-19
-
Evaluation and Recommendation of Pharmacopoeial Texts for Use in the ICH Regions Annex 11: Capillary Electrophoresis General Chapter - FDA Q4B - 09-10
ANNEXES
1.1 Constructeurs – Fournisseurs – Distributeurs (liste non exhaustive)
Agilent Technologies http://www.agilent.com
Prince Technologies http://www.princetechnologies.eu
ProteinSimple http://www.proteinsimple.com
QIAGEN http://www.qiagen.com
Sebia http://www.sebia.com
SCIEX http://www.sciex.com
ThermoFisher Scientific http://www.thermofisher.com
Wynsep http://www.wynsep.com
HAUT DE PAGE1.2 Organismes – Fédérations – Associations (liste non exhaustive)
Groupe CE de l’Association francophone des sciences séparatives (Afsep) http://www.afsep.com
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