Bibliographie & annexes
Présentation
En anglais
RÉSUMÉ
Les techniques d'imagerie vasculaire cérébrale IRM ou scanner constituent des outils incontournables aussi bien en diagnostic clinique qu'en recherche biomédicale. Si ces techniques restent non invasives, leur résolution au mieux millimétrique représente une limite dans l'observation des processus mis en jeu au niveau cellulaire. De fait, la microscopie de fluorescence à deux photons, de résolution micrométrique, s'impose comme un dispositif complémentaire majeur dans la recherche en neurobiologie et en oncologie. Cet article propose un descriptif de la technique mise en jeu dans ce type d'imagerie, du dispositif expérimental utilisé pour l'acquisition des données sur animal vivant, jusqu'à un état de l'art de la conception d'agents de contraste fluorescents pour l'utilisation in vivo.
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MRI or CT-scan based cerebral vascular imaging techniques are nowadays major tools both in the field of biomedical research and clinical diagnostic. However, their millimetric resolution does not give access to processes taking place at the microscopic level. For that reason, two-photon fluorescence microscopy with micrometric resolution, has emerged as a complementary technique in mainly neurobiological and oncology research. This article provides a description of i) two-photon microscopy, ii) the experimental setup used for data acquisition on living animals, and iii) a review on the state of-art in fluorescent probes design as contrast agents for in vivo applications.
Auteur(s)
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Florence APPAIX : Ingénieur d'études - Plateforme de microscopie biphotonique – IBiSA ISdV, Institut des neurosciences de Grenoble, UJF – INSERM U836, Grenoble, France
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Cyrille MONNEREAU : Maître de conférences - Laboratoire de chimie de l'ENS de Lyon, UMR CNRS 5182, université de Lyon, Lyon, France
-
Boudewijn VAN DER SANDEN : Chercheur INSERM - Responsable plateforme microscopie intravitale, France Life Imaging - Clinatec, Grenoble, France
INTRODUCTION
Le sang est un milieu liquide complexe responsable à la fois de l'acheminement de l'oxygène et des nutriments vers les différentes cellules, mais aussi de l'élimination des déchets générés par le métabolisme de ces dernières. Chez les vertébrés, le sang est composé de cellules que sont les globules rouges, les globules blancs et les thrombocytes ou plaquettes en suspension dans le plasma. On trouve aussi dans ce dernier des protéines comme l'albumine, du glucose et des hormones.
Le système vasculaire peut connaître des dysfonctionnements et provoquer des ischémies transitoires ou permanentes ; ainsi l'infarctus du myocarde ou les accidents vasculaires cérébraux (AVC) entraînent souvent la nécrose d'une partie des cellules qui n'ont plus été oxygénées correctement. Le système vasculaire peut également subir de profondes réorganisations autour et dans les tumeurs cancéreuses avec la création d'un réseau vasculaire dense et ramifié, processus connu sous le terme de « néoangiogénèse ».
Le cerveau est un organe dont le réseau vasculaire est extrêmement dense et complexe. Les techniques de visualisation du système vasculaire, cérébral en particulier, sont donc des outils incontournables des sciences biomédicales, utilisés aussi bien dans un contexte de diagnostic chez l'homme que de recherche fondamentale sur l'animal.
Les techniques actuellement utilisées pour la visualisation des vaisseaux sanguins chez l'homme sont l'angiographie par tomodensitométrie (angioCT) ou par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces techniques sont certes non invasives, mais ne permettent pas une résolution à l'échelle microscopique.
Pour des applications nécessitant de telles résolutions, la microscopie optique de fluorescence à deux photons constitue un outil de premier plan. Dans cet article, nous passerons en revue les avantages et limites de cette technique, définirons son domaine d'utilisation, avant de présenter en détail le dispositif mis en œuvre pour l'acquisition des images et le type d'agents de contraste utilisés.
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MOTS-CLÉS
état de l'art Microscopie optique tri-dimensionnelle Sondes fluorescentes non linéaires oncologie Recherche biomédicale neurosciences
KEYWORDS
state of the art | Tridimensional optical microscopy | Nonlinear fluorescent probes | oncology | Biomedical research | neurosciences
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Sondes fluorescentes à deux photons pour l'imagerie intravitale et vasculaire cérébrale
En anglais
2. Dispositifs d'imagerie vasculaire cérébrale par microscopie à deux photons
2.1 Microscope à deux photons
Ainsi que nous l'avons vu plus haut, l'un des dispositifs les plus pertinents pour la microscopie intravitale est le microscope à deux photons. Dans la recherche biomédicale et les études précliniques sur animaux, ce microscope est composé d‘un statif droit, d'une source laser infrarouge (IR) pulsée et d‘un scanner optimisé pour l'IR (figure 2). Contrairement à son homologue confocal, il n'aura pas besoin, compte tenu de la nature biphotonique de l‘excitation, d'un diaphragme (pin-hole ) pour sélectionner la fluorescence émise au plan focal de l'objectif. Les cinq principaux fabricants de microscopes multiphotons sont Zeiss (LSM 7MP), Olympus (Fluoview ®), Nikon (A1R MP), Leica (TCS MP5, TCS SP8 MP) et LaVision BioTec GmbH (TriMScope II). Dans ce qui suit, nous allons nous attacher à détailler les arguments guidant le choix de chaque élément de cette configuration.
HAUT DE PAGE2.1.1 Source lumineuse utilisée
2.1.1.1 Lasers pour l'excitation à deux photons
Pour l'excitation à deux photons, le flux et la densité des photons dans le plan focal de l'objectif doivent être très importants, car le transfert d'état énergétique avec deux photons est de probabilité incomparablement plus faible par rapport à une excitation à un photon. La probabilité d'excitation par absorption de deux photons est quantifiée par la section efficace d'absorption à deux photons σabs-2p qui a pour unité le cm4s et s'exprime en Göppert-Mayer (1 GM = 10–50 cm4s, alors que l'ordre de grandeur d'une absorption monophotonique σabs-1p et de 10–16 cm2). Le nombre de photons absorbés par molécule par unité de temps étant proportionnel au carré de l'intensité instantanée, les flux de photons nécessaires à la réalisation d'une absorption biphotonique efficace sont inatteignables avec des sources classiques. Il a donc fallu attendre l'arrivée des premiers lasers pulsés femto accordables (Titane-Saphir...
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Dispositifs d'imagerie vasculaire cérébrale par microscopie à deux photons
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - KIM (S.G.) - Perfusion MR imaging : evolution from initial development to functional studies. - Neuroimage, 62(2), p. 672-675 (2012).
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(2) - KLEINFELD (D.), MITRA (P.P.), HELMCHEN (F.), DENK (W.) - Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. - Proc. Natl. Acad. Sci., États-Unis, 95(26), p. 15741-15746 (1998).
-
(3) - PERLES-BARBACARU (A.T.), VAN DER SANDEN (B.P.), FARION (R.), LAHRECH (H.) - How stereological analysis of vascular morphology can quantify the blood volume fraction as a marker for tumor vasculature : comparison with magnetic resonance imaging. - J. Cereb. Blood. Flow. Metab., 32(3), p. 489-501 (2012).
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(4) - VAN DER SANDEN (B.P.) et al - Noninvasive assessment of the functional neovasculature in 9L-glioma growing in rat brain by dynamic 1H magnetic resonance imaging of gadolinium uptake. - J. Cereb. Blood. Flow. Metab., 20(5), p. 861-870 (2000).
-
(5) - FAYAD (Z.A.), FUSTER (V.), NIKOLAOU (K.), BECKER (C.) - Computed tomography and magnetic resonance imaging for noninvasive coronary angiography and...
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ANNEXES
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