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RÉSUMÉ
La diffraction des rayons X par des monocristaux est la méthode par excellence pour la détermination des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques à l’échelle atomique. La cristallographie a permis la détermination des structures tridimensionnelles de plusieurs dizaines de milliers de macromolécules biologiques dans des gammes de taille et de complexité très variées. Cet article traite des étapes de cristallisation et des collectes des données de diffraction en développant les spécificités propres aux cristaux de macromolécules biologiques.
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Jean CAVARELLI : Professeur de biologie structurale Université de Strasbourg Département de biologie structurale intégrative IGBMC,CNRS UMR 7104-Inserm U 1258, Strasbourg-Illkirch, France
INTRODUCTION
La diffraction des rayons X par des monocristaux est la méthode par excellence pour l’étude des macromolécules biologiques à l’échelle atomique. Le processus de détermination d’une structure de macromolécule biologique par diffraction des rayons X sur des cristaux est schématiquement divisé en six étapes :
-
obtention de la macromolécule à l’état pur (ou des macromolécules dans le cas d’assemblages) ;
-
cristallisation ;
-
collecte de données de diffraction ;
-
phasage ;
-
construction de la structure cristallographique par interprétation des cartes de densité électronique ;
-
affinement et validation de la structure.
Les trois dernières étapes sont décrites dans l’article [P 1 111].
Cet article traite des premières étapes de ce processus jusqu’à l’obtention des donnés de diffraction. Ces étapes se caractérisent par une miniaturisation et une automatisation poussée avec une intervention humaine de plus en plus réduite. Les propriétés physico-chimiques intrinsèques des macromolécules biologiques donnent naissance à des cristaux avec de grands paramètres de maille cristalline et un pouvoir de diffraction en général limité en comparaison du standard des petites molécules organiques. En décembre 2018, 57 % des structures cristallographiques déposées à la base de données RCSB PDB ont une limite de diffraction moins bonne que 2 Å et seulement 13 % une limite de diffraction meilleure que 1,6 Å. Cela impose des méthodes et des techniques adaptées tout au long du processus cristallographique. Cette méthodologie propre aux macromolécules biologiques va être présentée dans cet article.
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- Version archivée 1 de sept. 2009 par Jean CAVARELLI
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Cristallisation
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2. Purification des macromolécules biologiques
L’obtention de cristaux de qualité nécessite de disposer le plus souvent de plusieurs milligrammes de la macromolécule d’intérêt à l’état soluble et avec une très grande pureté. Les premières structures tridimensionnelles de macromolécules correspondaient à des molécules qui pouvaient facilement être obtenues en grande quantité et qui cristallisaient relativement facilement. Aujourd’hui, on aborde une étude cristallographique d’une macromolécule pour résoudre un problème biologique donné. La macromolécule cible peut être disponible en faible quantité, voir pratiquement insoluble. Néanmoins, la croissance importante du nombre de structures tridimensionnelles résolues vient de l’utilisation des techniques de la biologie moléculaire. Dès que le gène correspondant à la protéine étudiée a pu être identifié, il peut être cloné dans un vecteur d’expression et exprimé dans une cellule hôte procaryotique ou eucaryotique. Les systèmes de surexpression les plus utilisés pour les études structurales sont la bactérie Escherichia coli, les cellules d’insectes associées à un vecteur baculovirus, des cellules de mammifères et la levure. Le système bactérien est le plus facile d’utilisation et permet dans de nombreux cas un niveau élevé de surexpression. Néanmoins, ce système présente deux inconvénients majeurs :
-
de nombreuses protéines eucaryotiques ne se replient pas correctement et précipitent sous forme d’amas insolubles de protéines appelés corps d’inclusion ;
-
de nombreuses modifications post-traductionnelles spécifiques aux systèmes d’origine eucaryotique ne sont pas effectuées.
Dans de nombreux vecteurs d’expression, la protéine est fusionnée soit avec une autre protéine particulière, soit avec une queue peptidique, ce qui permet une première étape de purification par colonne d’affinité.
l’addition d’une queue polyhistidine permet une première purification de la protéine sur une colonne d’affinité en présence d’ions nickel que chélate la séquence polyhistidine. Un site de clivage à une protéase donnée permet ensuite l’obtention de la protéine seule.
Les techniques de génie génétique permettent aussi d’apporter...
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Purification des macromolécules biologiques
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - GRIMES (J.M.), HALL (D.R.), ASHTON (A.W.), EVANS (G.), OWEN (R.L.), WAGNER (A.), McAULEY (K.E.), von DELFT (F.), ORVILLE (A.M.), SORENSEN (T.) et al - Where is crystallography going ? - Acta Crystallogr. D. Struct. Biol., 74, p. 152-166 (2018).
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(2) - HELLIWELL (J.R.) - New developments in crystallography : exploring its methods, technology and scope in the molecular biosciences. - Biosci. Rep. (2017).
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(3) - GRABOWSKI (M.), NIEDZIALKOWSKA (E.), ZIMMERMAN (M.D.), MINOR (W.) - The impact of structural genomics : the first quindecennial. - J. Struct. Funct. Genomics, 17, p. 1-16 (2016).
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ANNEXES
Biologie structurale intégrative et plateformes technologiques
à l’echelle européenne, Instruct-ERIC https://www.structuralbiology.eu
une infrastructure francaise, FRISBI http://frisbi.eu
Structural biology knowledgebase http://sbkb.org/
Sources de rayonnement synchrotron
« A Structural Biologist’s Guide to High Energy Data Collection Facilities » http://biosync.sbkb.org
« the world’s light source facilities » https://lightsources.org/
SOLEIL https://www.synchrotron-soleil.fr/
ESRF http://www.esrf.eu/
Source XFEL européenne
« European XFEL » https://www.xfel.eu
Détecteurs
Pilatus et Eiger https://www.dectris.com/
Outils pour la cristallisation
Hampton Research https://hamptonresearch.com
Molecular Dimensions https://www.moleculardimensions.com
Qiagen https://www.qiagen.com
Jena Bioscience https://www.jenabioscience.com/
Pipelines de références en biocristallographie
Phenix http://www.phenix-online.org
Global...
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