Bibliographie & annexes
Présentation
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RÉSUMÉ
La protéomique est une science récente qui étudie les protéines, elle donne ainsi accès à l’expression génique d’une cellule, d’un tissu ou d’un organe, grâce à l'étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. Une analyse protéomique débute par l’extraction des protéines à partir de la matrice biologique, les conditions de cette préparation de l’échantillon, notamment le choix des agents de solubilisation, sont déterminantes. Les protéines sont ensuite séparées et purifiées par électrophorèse bidimensionnelle, puis leur analyse réalisée par spectrométrie de masse. Ces étapes sont généralement suivies de l’identification des protéines et de leur quantification par méthode différentielle ou absolue.
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Alexia ORTIZ : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et technologies, Villeneuve d'Ascq
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Caroline TOKARSKI : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et Technologies, Villeneuve d'Ascq
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Christian ROLANDO : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et technologies, Villeneuve d'Ascq
INTRODUCTION
La protéomique est une science récente qui étudie les protéines. Le terme « protéome », proposé en 1995 , désigne l'ensemble des protéines exprimées par le génome d'une cellule, d'un tissu ou encore d'un organe à un moment précis de son développement.
Même si le séquençage du génome humain est aujourd'hui achevé, l'étude du génome comporte des limites. Sa connaissance ne permet pas d'appréhender la complexité du fonctionnement cellulaire. Un même génome conduit à l'expression de plusieurs protéomes en fonction des étapes du cycle cellulaire, de l'état physiopathologique de la cellule. Enfin, les protéines peuvent subir de nombreuses modifications indépendamment de la seule expression du gène codant. L'analyse protéomique permet donc une description dynamique de la régulation de l'expression génique, grâce à l'étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles.
L'analyse protéomique trouve deux champs d'applications : d'une part, l'identification des protéines pour un organisme donné (localisation intracellulaire, interactions protéine-protéine) et, d'autre part, la connaissance des niveaux d'expression des protéines et des effets d'agents extérieurs (pathologies, traitements médicamenteux, facteurs environnementaux, etc.).
L'analyse protéomique repose principalement sur une méthodologie couplant l'électrophorèse bidimensionnelle (2D-PAGE), technique possédant un pouvoir résolutif très élevé, et la spectrométrie de masse. Une analyse protéomique classique peut ainsi se résumer par :
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extraction des protéines à partir d'un matériel biologique donné ;
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séparation des protéines par électrophorèse ;
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analyse de ces protéines par spectrométrie de masse.
Outre ces trois étapes, nous compléterons cette présentation par une description du traitement des données (interrogation de banques de données pour l'identification des protéines et/ou de leurs modifications), une introduction aux approches protéomiques basées sur des techniques alternatives, et pour finier sur les différentes approches d'une étude protéomique ainsi que les différentes techniques de quantification des protéines.
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Grands domaines d'application de la protéomique
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4. Quantification
4.1 Quantification différentielle
4.1.1 Marquage métabolique isotopique
La technique de marquage métabolique isotopique repose sur l'utilisation de milieux de culture modifiés incorporant des acides aminés marqués à la place d'acides aminés natifs. Ainsi, les protéines provenant de cellules issues de ces milieux de culture modifiés incorporent dans leurs séquences les acides aminés marqués. En conséquence, cette technique limite le domaine d'application aux protéines issues de cellules en culture. La méthodologie d'incorporation isotopique a été présentée pour la première fois en 2002 par Matthias Mann et collaborateurs, dans le cadre d'une analyse protéomique différentielle comparant des échantillons issus de milieux de culture non modifiés à des échantillons issus de milieux de culture modifiés ; la technique est appelée SILAC pour Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture . L'analyse différentielle se fait alors à partir des spectres MS ou des chromatogrammes d'ions extraits en comparant les aires sous les pics obtenus pour les peptides incorporant les acides aminés légers (natifs) et les acides aminés lourds. Par exemple, la figure 8 présente un spectre MS comportant un peptide incorporant une lysine native (lysine « légère » C6H12N2O) et un peptide incorporant une lysine « lourde » 13C6H12 15N2O. Le Δm du couple peptidique est caractéristique de l'écart de masse (m /z avec z = 3 ici) entre lysine légère et lourde. Ici, le peptide comportant la lysine lourde est légèrement sous exprimé. Les acides aminés marqués les plus couramment utilisés sont : les lysines...
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BIBLIOGRAPHIE
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