Bibliographie & annexes
Présentation
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RÉSUMÉ
La PCR (réaction de polymérisation en chaîne) digitale représente un saut technologique dans la détection et la quantification de séquences rares d'ADN, comme certaines mutations spécifiques des tumeurs. La détection de ces séquences est d'un grand intérêt pour la prise en charge clinique des patients. En effet, leur détection dans les tumeurs ou les fluides biologiques, comme le plasma ou l'urine, pourrait permettre d'adapter le traitement aux caractéristiques moléculaires précises de la tumeur et de limiter les risques de récidive. Après une rapide présentation du contexte des recherches, l'article se penche sur le cancer et ses biomarqueurs, afin d'enchaîner sur l'émergence de la PCR digitale, et enfin explore les perspectives et potentielles évolutions de la PCR digitale.
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Philippe NIZARD : Ingénieur de recherche au sein de l'UMRS1147, Université Sorbonne Paris Cité, INSERM UMR-S1147, centre universitaire des Saints-Pères, Paris, France
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Aurélie KROL : Ingénieur de recherche au sein de l'UMRS1147, Université Sorbonne Paris Cité, INSERM UMR-S1147, centre universitaire des Saints-Pères, Paris, France
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Pierre LAURENT-PUIG : PU-PH, Directeur de l'UMRS1147, Université Sorbonne Paris Cité, INSERM UMR-S1147, centre universitaire des Saints-Pères, Paris, France
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Valérie TALY : Chargée de recherche CNRS (CR1) - Responsable du groupe « Recherche translationnelle et microfluidique », Université Sorbonne Paris Cité, INSERM UMR-S1147, centre universitaire des Saints-Pères, Paris, France
INTRODUCTION
Domaine : Analyse génétique
Degré de diffusion de la technologie : Émergence | Croissance | Maturité
Technologies impliquées : Microfluidique, PCR digitale, PCR, PCR quantitative, biologie moléculaire
Domaines d'application : Recherche de biomarqueurs du cancer
Principaux acteurs français : GDR Micro et Nano Fluidique
Contact : [email protected] ; [email protected]
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Perspectives et évolutions
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3. De la PCR à la PCR digitale
3.1 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La PCR est devenue la technique la plus utilisée pour détecter des séquences d'acides nucléiques. Elle consiste en l'amplification spécifique d'une séquence connue d'ADN à partir d'une faible quantité de copies de départ à l'aide d'amorces spécifiques et d'une enzyme, la polymérase. La séquence connue est alors amplifiée de manière exponentielle (figure 2).
La détection des produits amplifiés est réalisée grâce à l'ajout de molécules fluorescentes se liant à l'ADN double brin comme le SYBR Green ou de sondes fluorescentes, comme celles utilisées par la technologie TaqMan® (figure 3).
Grâce à la PCR quantitative en temps réel, la cinétique de la réaction peut être suivie en mesurant la fluorescence liée à la quantité d'ADN qui augmente à chaque cycle. Cette technologie offre l'avantage d'être quantitative, dans le sens où elle peut donner une estimation de la quantité de séquences cibles dans l'échantillon de départ, en opposition à la PCR dite en « point final » où la détection de l'amplification n'est réalisée qu'à la fin de la réaction et n'est pas quantitative (figure 4).
La PCR digitale, qui consiste à partitionner l'échantillon en un grand nombre de compartiments indépendants et d'y réaliser les expériences de PCR en parallèle, permet d'augmenter la sensibilité de détection d'une séquence connue au sein d'un mélange complexe d'ADN avec une sensibilité très augmentée, comparée à la PCR quantitative pour un même test. Par exemple, la PCR digitale en microgouttelettes a permis des augmentations de sensibilité de plus de 1 000 fois ...
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De la PCR à la PCR digitale
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - KRZYSZTOF (C.), TOMASZ (S.K.), SLAWOMIR (J.) et al - Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. - Lab. Chip., 12, p. 1629-1637 (2012).
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(2) - BROUZES (E.), MEDKOVA (M.), SAVENELLI (N.) et al - Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. - Proc. Natl. Acad. Sci., États-Unis, 106, p. 14195-14200 (2009).
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(3) - STRAIN (M.C.), LADA (S.M.), LUONG (T.) et al - Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. - PLoS One, 8 (2013).
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(4) - EVANS (M.I.), WRIGHT (D.A.), PERGAMENT (E.) et al - Digital PCR for noninvasive detection of aneuploidy : power analysis equations for feasibility. - Fetal diagnosis and therapy, 31, p. 244-247 (2012).
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(5) - TALY (V.), PEKIN (D.), EL ABED (A.), LAURENT-PUIG (P.) - Detecting biomarkers with microdroplet technology. - Trends. Mol. Med., 18, p. 405-416 (2012).
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