Bibliographie & annexes
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RÉSUMÉ
La chromatographie en phase liquide HPLC est une technique analytique employée dans de nombreux secteurs d'activité. Des solutions innovantes en termes de phases stationnaires et d'instruments sont apparues afin d'en augmenter la productivité. En parallèle, des stratégies orthogonales permettant de modifier la sélectivité et la rétention se sont développées. Enfin, cette technique s'est aussi adaptée à la caractérisation de protéines thérapeutiques, en plein essor dans le domaine pharmaceutique.
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High performance liquid chromatography (HPLC) is an analytical technique suitable for a large variety of applications. Some innovative solutions, in terms of stationary phases and instrumentation, were introduced to improve productivity. In parallel, some alternative strategies allowing severe modifications of selectivity and retention were also developed. Finally, this approach was also adapted for the characterisation of therapeutic proteins, which is currently a hot topic in the pharmaceutical industry
Auteur(s)
-
Davy GUILLARME : Chargé d'enseignement Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, École des Sciences pharmaceutiques, Université de Genève
INTRODUCTION
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique clé, utilisée dans de nombreux secteurs d'activité, pour l'analyse de matrices agroalimentaires, environnementales et pharmaceutiques. Cette technique séparative peut être utilisée aussi bien pour des analyses purement qualitatives, que pour des applications quantitatives. Durant ces dernières années, les technologies employées en HPLC (phases stationnaires, phases mobiles, instrumentation...) ont évolué de manière très rapide, afin de répondre à certaines exigences des utilisateurs. Trois axes principaux d'amélioration ont été suivis.
Le premier axe de développement de l'HPLC est l'augmentation du débit d'analyse, afin d'obtenir des séparations cinq à dix fois plus rapides qu'auparavant, ainsi que la possibilité d'atteindre des séparations à plus haut pouvoir de séparation (à haute résolution). Pour cela, il est possible d'utiliser des supports chromatographiques innovants tels que les colonnes monolithiques, les colonnes remplies de particules poreuses de moins de 2 μm ou les colonnes remplies de particules superficiellement poreuses de moins de 3 μm. Il est également important de garder en tête qu'une augmentation de la température de la phase mobile permet une amélioration significative des performances chromatographiques. Cependant, afin de tirer tous les bénéfices de la chromatographie rapide et/ou à haute résolution, une instrumentation adaptée est nécessaire et des développements importants ont été réalisés dans ce sens au cours des dix dernières années.
Un autre axe de développement concerne l'utilisation de modes alternatifs de chromatographie. En effet, la chromatographie liquide à polarité des phases inversées (RPLC) est de loin la plus utilisée aujourd'hui mais il peut être intéressant d'avoir recours à des modes de séparations alternatifs pour moduler les sélectivités et rétentions de certains composés problématiques. Deux modes peuvent avoir de l'intérêt, il s'agit de la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et de la chromatographie supercritique (SFC). La première de ces deux approches est particulièrement adaptée à l'analyse de composés très hydrophiles (sucres, acides aminés) et/ou ionisables (molécules pharmaceutiques), difficilement analysable en RPLC. La seconde convient à une gamme plus large d'analytes, dont en particulier les composés très lipophiles (lipides, vitamines liposolubles...) difficiles à éluer en RPLC classique.
Enfin, Le dernier axe de développement est plus spécifique du domaine pharmaceutique et concerne l'analyse de protéines et anticorps monoclonaux thérapeutiques ayant des masses molaires comprises entre 5 et 150 kDa. Pour ce type d'analyse, les techniques historiques, telles que la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et la chromatographie d'échange d'ions (IEX) sont désormais fortement concurrencées par les nouveaux supports chromatographiques à large taille de pores disponibles en RPLC et offrant une meilleure compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).
Le but de cet article est d'exposer les évolutions majeures de la chromatographie liquide, afin que les utilisateurs puissent appliquer ces nouvelles méthodologies dans leurs laboratoires respectifs. Pour la théorie et les différents méthodes, se reporter aux articles [P 1 445] et [P 1 455].
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KEYWORDS
HPLC | UHPLC | HILIC | SFC
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Analyse rapide ou à haute résolution en chromatographie4. Conclusion
La chromatographie liquide est une technique qui a fortement évolué depuis le début des années 2000, avec de nombreuses innovations technologiques (phases stationnaires, instruments HPLC et conditions analytiques) résumées sur la figure 14. Le but de ces améliorations est de répondre aux problèmes actuels qui sont la nécessité :
-
de pouvoir réaliser des analyses rapides/ultrarapides, en particulier dans le domaine pharmaceutique ;
-
d'obtenir des très hautes résolutions pour l'analyse de mélanges les plus complexes (extraits de plantes, protéomique, métabolomique humaine...) ;
-
d'avoir à disposition des modes de séparation alternatifs offrant des sélectivités/rétentions orthogonales à celles obtenues en RPLC (HILIC et SFC) ;
-
de conditions analytiques permettant l'analyse de macromolécules biologiques (protéines et mAbs thérapeutiques).
En parallèle de toutes ces innovations chromatographiques, des développements importants ont eu lieu dans le domaine de la spectrométrie de masse (MS), ce dernier devenant un mode de détection de référence. Aujourd'hui, les spectromètres de masse sont des outils très sensibles, rapides et faciles d'utilisation. Pour cette raison, il est inconcevable d'imaginer des développements en HPLC sans penser à un possible couplage avec la MS.
Une autre tendance de la chromatographie qui n'est pour l'instant testée que dans des laboratoires académiques est la chromatographie bidimensionnelle (2D-LC). Grâce à cette approche, particulièrement attractive pour l'analyse d'échantillons complexes, il est possible d'atteindre des pouvoirs de séparation bien plus importants que ceux de l'HPLC classique . Cependant, il reste encore un grand nombre de soucis techniques à résoudre avant que cette approche ne puisse être utilisée en routine dans des laboratoires industriels.
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Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - HEINISCH (S.), ROCCA (J.L.) - Sense and nonsense of high-temperature liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1216, p. 642-658 (2009).
-
(2) - GUILLARME (D.), HEINISCH (S.), ROCCA (J.L.) - Effect of temperature in reversed phase liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1052, p. 39-51 (2004).
-
(3) - NGUYEN (D.T.T.), GUILLARME (D.), HEINISCH (S.), BARRIOULET (M.P.), ROCCA (J.L.), RUDAZ (S.), VEUTHEY (J.L.) - High throughput liquid chromatography with sub-2 mm particles at very high pressure and high temperature. - Journal of Chromatography A, 1167, p. 76-84 (2007).
-
(4) - GUIOCHON (G.) - Monolithic columns in high-performance liquid chromatography. - Journal of Chromatography A, 1168, p. 101-168 (2007).
-
(5) - CABRERA (K.) - Applications of silica-based monolithic HPLC columns. - Journal of Separation Science, 27, p. 843-852 (2004).
-
(6)...
DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Congrès annuel HPLC http://www.hplc2014.org/
Congrès bi-annuel ISC http://www.isc2014.at/
Congrès bi-annuel HTC http://www.htc-conference.org/
HAUT DE PAGE2.1 Constructeurs – Fournisseurs – Distributeurs (liste non exhaustive)
Waters http://www.waters.com
Agilent technologies http://www.agilent.com
Shimadzu http://www.shimadzu.com
Thermo Scientific http://www.thermoscientific.com
HAUT DE PAGE2.2 Organismes – Fédérations – Associations (liste non exhaustive)
Association francophone des sciences séparatives,...
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