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RÉSUMÉ
La diffraction des rayons X par des monocristaux est la méthode par excellence pour la détermination des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques à l’échelle atomique. La cristallographie a permis la détermination des structures tridimensionnelles de plusieurs dizaines de milliers de macromolécules biologiques dans des gammes de taille et de complexité très variées. Cet article traite des étapes de cristallisation et des collectes des données de diffraction en développant les spécificités propres aux cristaux de macromolécules biologiques.
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Jean CAVARELLI : Professeur de biologie structurale Université de Strasbourg Département de biologie structurale intégrative IGBMC,CNRS UMR 7104-Inserm U 1258, Strasbourg-Illkirch, France
INTRODUCTION
La diffraction des rayons X par des monocristaux est la méthode par excellence pour l’étude des macromolécules biologiques à l’échelle atomique. Le processus de détermination d’une structure de macromolécule biologique par diffraction des rayons X sur des cristaux est schématiquement divisé en six étapes :
-
obtention de la macromolécule à l’état pur (ou des macromolécules dans le cas d’assemblages) ;
-
cristallisation ;
-
collecte de données de diffraction ;
-
phasage ;
-
construction de la structure cristallographique par interprétation des cartes de densité électronique ;
-
affinement et validation de la structure.
Les trois dernières étapes sont décrites dans l’article [P 1 111].
Cet article traite des premières étapes de ce processus jusqu’à l’obtention des donnés de diffraction. Ces étapes se caractérisent par une miniaturisation et une automatisation poussée avec une intervention humaine de plus en plus réduite. Les propriétés physico-chimiques intrinsèques des macromolécules biologiques donnent naissance à des cristaux avec de grands paramètres de maille cristalline et un pouvoir de diffraction en général limité en comparaison du standard des petites molécules organiques. En décembre 2018, 57 % des structures cristallographiques déposées à la base de données RCSB PDB ont une limite de diffraction moins bonne que 2 Å et seulement 13 % une limite de diffraction meilleure que 1,6 Å. Cela impose des méthodes et des techniques adaptées tout au long du processus cristallographique. Cette méthodologie propre aux macromolécules biologiques va être présentée dans cet article.
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- Version archivée 1 de sept. 2009 par Jean CAVARELLI
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Préambule
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5. Conclusion
La cristallographie des macromolécules biologiques occupe une place centrale dans la biologie moderne car la structure tridimensionnelle d’une macromolécule ou d’un complexe macromoléculaire permet d’apporter un éclairage neuf et original qui est essentiel pour comprendre la fonction biologique. C’est le plus souvent une révolution, et plusieurs prix Nobel ont couronné les succès les plus marquants. La purification de la (ou des) macromolécule(s) et l’obtention de cristaux de qualité (limite de diffraction meilleure que 3 Å) reste toujours deux étapes limitantes d’un projet structural.
Cet article qui présente les premières étapes du processus cristallographie doit être complété par l’article [P 1 111]. Les années 2000-2018 ont été riches en révolutions technologiques et méthodologiques. Poussés par des défis et challenges posés par la biologie en particulier, des investissements massifs dans les secteurs publics et privés ont été réalisés en cristallographie. Dans les cas simples, on détermine en routine des structures 3D à partir d’un nombre très limité de cristaux, parfois de très petites tailles (quelques μm) et cela avec un minimum d’intervention humaine. On entend ici par cas simple, des macromolécules qui, dans l’état actuel des connaissances méthodologiques et technologiques, peuvent être facilement purifiées et cristallisées, qui présentent un pouvoir de diffraction suffisant et pour lesquelles le problème des phases peut être résolu de manière classique (en particulier par la méthode MAD/SAD ou par la méthode du (rem)placement moléculaire).
Il faut parfois plusieurs mois ou plusieurs années d’investissements et de travail (voir parfois d’acharnement) en biochimie et en biophysique pour obtenir un échantillon de qualité qui donne des cristaux. Les collectes des données de diffraction sur un site synchrotron sont synonymes d’automatisation et robotisation procurant de nombreux outils technologiques et méthodologiques qui permettent de collecter des données complètes de diffraction de la meilleure qualité en quelques minutes. Cela reste néanmoins...
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BIBLIOGRAPHIE
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(1) - GRIMES (J.M.), HALL (D.R.), ASHTON (A.W.), EVANS (G.), OWEN (R.L.), WAGNER (A.), McAULEY (K.E.), von DELFT (F.), ORVILLE (A.M.), SORENSEN (T.) et al - Where is crystallography going ? - Acta Crystallogr. D. Struct. Biol., 74, p. 152-166 (2018).
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(2) - HELLIWELL (J.R.) - New developments in crystallography : exploring its methods, technology and scope in the molecular biosciences. - Biosci. Rep. (2017).
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(3) - GRABOWSKI (M.), NIEDZIALKOWSKA (E.), ZIMMERMAN (M.D.), MINOR (W.) - The impact of structural genomics : the first quindecennial. - J. Struct. Funct. Genomics, 17, p. 1-16 (2016).
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DANS NOS BASES DOCUMENTAIRES
ANNEXES
Biologie structurale intégrative et plateformes technologiques
à l’echelle européenne, Instruct-ERIC https://www.structuralbiology.eu
une infrastructure francaise, FRISBI http://frisbi.eu
Structural biology knowledgebase http://sbkb.org/
Sources de rayonnement synchrotron
« A Structural Biologist’s Guide to High Energy Data Collection Facilities » http://biosync.sbkb.org
« the world’s light source facilities » https://lightsources.org/
SOLEIL https://www.synchrotron-soleil.fr/
ESRF http://www.esrf.eu/
Source XFEL européenne
« European XFEL » https://www.xfel.eu
Détecteurs
Pilatus et Eiger https://www.dectris.com/
Outils pour la cristallisation
Hampton Research https://hamptonresearch.com
Molecular Dimensions https://www.moleculardimensions.com
Qiagen https://www.qiagen.com
Jena Bioscience https://www.jenabioscience.com/
Pipelines de références en biocristallographie
Phenix http://www.phenix-online.org
Global...
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